高效分子排阻色譜法測定頭孢氨芐原料藥中聚合物的含量

苑華，張冬，黃亞龍，張文勝（1.石家莊食品藥品檢驗所，石家莊05001；.河北省食品藥品檢驗院，石家莊 050011；.華北制藥河北華民藥業有限責任公司，石家莊 050000）

研究[1]表明，β-內酰胺類抗菌藥物引發的速發型過敏反應并非抗菌藥物本身所致，而是與藥物中存在的高分子聚合物雜質有關。頭孢氨芐收載于2010年版《中國藥典》（二部）[2]，其質量標準中未對高分子聚合物進行控制。為此，筆者建立了以TSK-GEL G2000SWXL為色譜柱的高效分子排阻色譜法[3]分析測定頭孢氨芐中聚合物含量的方法，結果表明該法分離效能高、檢驗周期短、結果準確可靠。

1 材料

LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津公司）。

頭孢氨芐對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：130408-200710，純度：94.4%）；頭孢氨芐原料藥樣品（華北制藥河北華民藥業有限責任公司，樣品1：批號：20120101，純度：95.1%；樣品2：批號：20120102，純度：95.2%；樣品3：批號：20120103，純度：95.2%）；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：TSK-GEL G2000SWXL（300 mm×7.8 mm，5 μm）；流動相：0.005 mol/L磷酸鹽緩沖液[0.005 mol/LNaH2PO4溶液-0.005 mol/L Na2HPO4（39∶61，V/V）]-乙腈（95∶5，V/V），流速：0.6 ml/min；檢測波長：220 nm；進樣量：20 μl。

2.2 溶液的制備及測定方法

取樣品適量，精密稱定，加水制成每1 ml中含頭孢氨芐2.0 mg的溶液，作為供試品溶液（臨用新制）；另取頭孢氨芐對照品適量，精密稱定，加水制成每1 ml中約含20μg的溶液，作為對照溶液。分別進樣測定，按外標法以峰面積計算保留時間小于頭孢氨芐的雜質總量。結果見圖1。

2.3 破壞試驗

高溫破壞：取頭孢氨芐對照品溶液（2.0 mg/ml）10 ml，于60℃水浴中放置10 min，取出，冷卻至室溫。

堿破壞：稱取頭孢氨芐對照品約20 mg，置于10 ml量瓶中，加0.1 mol/L NaOH溶液1.0 ml溶解，放置1 min后，加0.1 mol/L HCl 1.0 ml，用水稀釋至刻度。

酸破壞：稱取頭孢氨芐對照品約20 mg，置于10 ml量瓶中，加0.1 mol/L HCl溶液1.0 ml溶解，放置4 h后，加0.1 mol/L NaOH 1.0 ml，用水稀釋至刻度。

氧化破壞：稱取頭孢氨芐對照品約20 mg，置于10 ml量瓶中，加3%H2O2溶液1.0 ml溶解，放置5 min后，用水稀釋至刻度。

光破壞：取頭孢氨芐對照品溶液（2.0 mg/ml）10 ml，于5000 lx照度下放置8 h。

采用選定的色譜條件取上述溶液進樣測定。結果表明，破壞處理之后的樣品雜質峰均有所增加，且各主峰前聚合物峰均能與主成分峰充分分離，其保留時間與未破壞樣品溶液色譜圖中的聚合物峰一致。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.4 標準曲線的建立

精密稱取頭孢氨芐對照品適量，加水溶解并稀釋制成系列線性試驗溶液，質量濃度分別為0.56、1.0、2.0、3.5、7.0、14.0、28.0 μg/ml，進樣測定，并以相應組分的色譜峰面積（A）對其質量濃度（c）進行線性回歸，得回歸方程如下：A＝55592c－1474.1（r＝0.9999）。結果表明，頭孢氨芐檢測質量濃度線性范圍為0.56～28.0 μg/ml。

2.5 檢測限及定量限試驗

精密稱取頭孢氨芐對照品適量，分別用水稀釋成每1 ml中含頭孢氨芐10、5、2.5、1、0.5 μg的系列溶液，進樣測定，按信噪比為3測得頭孢氨芐檢測限為1.0 ng，按信噪比為10測得定量限為3.0 ng。

2.6 精密度試驗

取質量濃度為7.0 μg/ml對照品溶液連續進樣6次，結果頭孢氨芐峰面積的RSD＝0.3%（n＝6），表明本法精密度好。

2.7 重復性試驗

平行制備6份供試品溶液，分別立即進樣分析，測定聚合物的總量。結果RSD＝2.4%（n＝6），表明本法重復性良好。

2.8 穩定性試驗

取含頭孢氨芐2.0 mg/ml的供試品溶液適量，在室溫下放置，于0、1、2、3、4、5、6、7、8 h分別測定，8 h內雜質峰面積之和逐漸增大，3～4 h增加較大，表明供試品溶液不穩定。因此供試品溶液應臨用新制。

2.9 樣品中聚合物的測定

按“2.2”項下方法對3批樣品進行檢測，結果見表1。

表1 3批樣品中聚合物測定結果Tab 1 Results of content determination of polymers in 3 batches of samples

3 討論

（1）緩沖液的選擇。在前期試驗中筆者對不同離子強度的磷酸鹽緩沖液作為流動相進行了考察，A為0.0025 mol/L，B為0.005 mol/L，C為0.01 mol/L。試驗結果表明，A與C所檢出的雜質峰較少，B所檢出的雜質峰較多且實現了主峰與雜質峰間的有效分離，故選擇0.005 mol/L磷酸鹽緩沖液。

（2）流動相中乙腈比例的選擇。分別選取乙腈比例為5%、10%進行考察。結果，乙腈比例為5%時檢出色譜峰較多，故流動相選用乙腈比例為5%。

（3）流動相pH值的選擇。頭孢類抗菌藥物在堿性、偏酸性及酸性條件下極易發生聚合反應，測得的聚合物含量難以反映樣品本身的實際情況。故筆者參考2010年版《中國藥典》（二部）相關內容，采用pH值7.0的磷酸鹽緩沖液為流動相。

（4）檢測波長的選擇。用二極管陣列檢測器測定堿破壞供試品溶液，采集到主峰前各高分子雜質峰的紫外光譜圖，雜質1～3的最大吸收波長集中于220～230 nm波長范圍內；雜質4未見明顯吸收峰，但于240～200 nm波長范圍內呈現遞增的吸收狀態；雜質5于262 nm波長處呈現最大吸收，其吸收值與220 nm波長處的吸收值較接近；頭孢氨芐于257 nm波長處呈現最大吸收，其吸收值亦與220 nm波長處的吸收值較接近。為保證最大雜質檢出量，檢測波長定為220 nm。

（5）由于結構不同的聚合物通常具有相同的生物學特性，且聚合物又具有高度的不均一性，因此在藥品質量控制中只需控制聚合物總量即可[1]。

（6）本方法與以葡聚糖凝膠Sephadex G-10作為分離介質的分子排阻法[4]相比較，具有檢驗周期短（本文方法約20 min，葡聚糖凝膠Sephadex G-10方法約為60 min）、操作簡單、分離效果好的優點，這可能是因為TSK-GEL G2000SWXL系球型硅膠基質在其表面通過共價鍵化學鍵合親水基團構成的物質，其吸附及分子篩效應強于Sephadex G-10葡聚糖凝膠顆粒。以TSK-GEL G2000SWXL為色譜柱的方法是凝膠色譜發展的必然趨勢。

[1]袁雯瑋.高分子聚合物研究與中國藥典2005年版B2內酰胺類抗生素高分子聚合物修訂情況及操作要點[J].中國抗生素雜志，2005，30（12）：727.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：二部[S].2010年版.北京：中國醫藥科技出版社，2010：208.

[3]王成剛，曹軼，張喆，等.高效分子排阻色譜法分析頭孢噻肟鈉中的聚合物[J].藥物分析雜志，2009，29（5）：814.

[4]伍蓉.分子排阻色譜法測定頭孢氨芐聚合物[J].國外醫藥抗生素分冊，2012，33（2）：83.