溫度控制的PCR-CE微流控芯片的設計與制作

上海交通大學微納米科學技術研究院微米/納米加工技術重點實驗室 姜 川 張衛平 駱 健 陳文元 吳校生 崔 峰

1.引言

微流控芯片的研究和發展已成為生物與醫療等領域的一個重點課題，因此設計一種能夠完成某種實驗的功能化芯片平臺已成為科研人員關注的重點，性能良好的微流控芯片可以很好的解決實驗中所遇到的難題，并且相對于其他大型設備，具有結構微小、使用便捷和制作費用較低等優勢[1]。

基于上述微流控芯片的優勢所在，利用微加工技術的特點，制作出一種集成式的PCR-CE芯片，主要目的是利用其作為PCR反應與CE分離檢測的實驗平臺，較為方便與快捷的進行生物反應實驗。

2.PCR-CE芯片的設計模型

我們設計的PCR-CE微流控芯片主要是要把分子的PCR反應與CE檢測這兩部分功能實現在同一塊的芯片上，因為DNA的合成出的產物混在原料中，需要CE過程分離，并對產物進行檢測，所以這兩部分是一個連續的過程，相輔相成，因此將PCR與CE集成在同一塊芯片上，提高了生物檢測的效率。

本文設計的PCR-CE芯片為雙層結構，基于玻璃材料具有熱傳導效果好、光學性能較好、表面改性容易、生物性能好、電滲效果優良等特性，以及聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS)具有獲得高深寬比結構、生物性能較好、價格低廉和加工周期較短等特性[2]，采用PDMS-玻璃的復合芯片結構。其中PDMS材料可以作為PCR反應腔室和CE分離的制作材料；玻璃材料作為芯片的基底，同時兩者的封裝鍵合的工藝簡單實用，且封裝后效果較好，所以便于制作出PDMS-玻璃的結構芯片。

圖1 設計的PCR-CE的PDMS玻璃結構的微流控芯片的整體圖

圖2 PDMS蓋片的掩膜版

圖3 電極層的掩膜版

圖4 完整的PCR-CE芯片

圖5 溫度控制電路的實物圖

圖6 溫度電阻關系圖

圖7 整體系統的組裝圖

我們設計的微流控芯片主要由反應液進口、混合通道、PCR反應腔室、CE分離通道以及電極組成，其中反應液進口、混合通道、PCR反應腔室、CE分離通道在上層結構中，由PDMS制成，下層為玻璃基底，并在玻璃表面濺射一層Cr/Pt電極，并將上下兩層蓋片鍵合在一起，組成了一個完整的PDMS-玻璃微流控芯片。如圖1所示為設計的PCRCE的PDMS-玻璃微流控芯片的整體圖。

3.加工與制備

加工制備芯片主要采用MEMS工藝，分別對芯片的上層PDMS蓋片與下層Pt電極層進行微加工處理。下面主要講解芯片的加工過程。

3.1 掩膜版的制作

設計圖形的畫制是利用AutocAD2009軟件，制作過程對圖形的寬度和相對位置要嚴格控制。掩膜版的材料選擇為菲林版，這種版質加工速度快，容易得到，即采用分辨率較高的打印機用透明膠片對準打印剪裁便可得到，精度適合要求在線寬為30μm以上的圖形結構，但是菲林版本身材質問題，光刻時需要粘在玻璃基板上使用，完全符合本芯片的要求。PDMS蓋片加工采用負膠掩膜版，而Pt電極基板需要在玻璃基板上濺射一層Pt電極，因此采用正膠掩膜版制作。圖2為PDMS蓋片的掩膜版，圖3為Pt電極層的掩膜版。

3.2 PDMS模具的制作

在制作PCR腔室和CE分離通道時，PDMS材料是不能直接進行微加工制作的，需要采用模塑法取得所需要的圖形。即前期運用微加工技術在一塊基底上加工出凸起的模型作為取膜工具，在模具上利用PDMS的固化過程取得微通道的圖形，最后將復制的圖形材料剝離開，便可以得到所需要的通道圖形。

制備過程采用SU-8負膠顯影得到，過程為：1)甩膠，采用濺射Cr/Cu的玻璃基底，用光刻機甩Su-8膠平鋪整個基底，轉速大約為2000R/min；2）前烘，將甩膠好的基板先防治60℃的恒溫箱內10min，再放入90℃環境中50min，目的是提高膠體與基底金屬的結合力；3）曝光，利用PDMS蓋片的掩膜版在曝光機下進行2min的曝光；4）顯影，先在粗顯影液中將后烘好的基板上下移動，大約1min后，再在精顯液中上下移動，大約30s；5）后烘，顯影好的基板放入180℃烘箱內約3h后，取出便可以使用。

3.3 制作上層PDMS蓋片

PDMS未使用前由兩部分組成，為樹脂和固化劑，兩種物質均為液態。當使用時，樹脂與固化劑按10：1的比例混合。制作所需的PDMS上層蓋片時，將已經配好的PDMS混合物質澆注到已經制作好的負膠圖形的模具上，并放置在一定高度的容器或者其他環境上，因為需要控制澆注的高度，如果直接澆注則流體會流出蓋片范圍。大約澆注的厚度為5mm-7mm左右，這樣便于在蓋面的出口處鍵合管道入口管和防止外界空氣進入蓋片內部，而過厚的話將會引起固化過程出現形變嚴重，無法取到圖形。待澆注完畢后，放置于真空泵中進行抽氣，30min后取出，將之放置60℃的烘箱內進行固化處理，大約放置4個小時固化完全取出進行脫模處理[3]。

3.4 Pt電極層的制備

下層基板選用3.3英寸、1mm厚的玻璃基底，并在玻璃基底上加工一層鉑電極[4]，具體過程如下：1)將上一步清洗干凈的玻璃基底取出，用濺射機濺射一層3000A的厚的Pt金屬層；2)將一濺射好的鉑金屬層的玻璃基板甩上正膠，根據所需電極的線寬不同，正膠的厚度大約為5-6um，如果線寬變大則甩膠的厚度也會相應提高；3)將甩好膠的基片用光刻機進行光刻處理，取出后立即進行顯影過程，其中粗顯大約1min左右，精顯30s左右，同樣需要用鑷子夾住基板，在顯影液中上下移動；4)將顯影好的片子用專用的濺射刻蝕機進行等離子體照射擊打，這樣便能將未能用正膠覆蓋部分的犧牲層去除；5)最后為了得到圖形化的金屬層，用丙酮和酒精去除覆蓋在基片表面的正膠，即可得到最終圖形化的Pt電極，作為下層基板使用。

3.5 PDMS蓋片與Pt電極層的鍵合

在已圖形化的Pt電極上甩一層很薄的PDMS，然后迅速放置甩膠機上，調至3000r/s的速度約1min左右[5]，這樣便能得到一層很薄的PDMS層，同時放置60℃的烘箱內固化；同時將上層PDMS蓋片放置等離子去膠機內照射約1min左右取出，這時將下層電極基板從烘箱取出，這時候由于PDMS的固化作用，處于基本固化形成，但是仍有粘性的狀態，這樣在鍵合時便更能增加兩者的結合力和提高封裝的穩定性。鍵合過程要注意對準環節，因為上下兩層圖形都有對準符號，只要把對準符號找準鍵合即可。待鍵合完畢后，需要使PDMS薄層完全固化，所以需要再次將封裝好的芯片放置60℃烘箱內。

此時一個完整的PDMS-玻璃的PCR-CE芯片便制作成功，可以進行后續的加熱和溫度檢測使用，并為PCR擴增提供一個完整的實驗平臺。圖4為已制備加工成的PCR-CE芯片的成品。

4.PCR-CE芯片的溫度控制電路設計

PCR的合成過程最核心的就是溫度控制，即在變性、退火、延伸這三個過程依次穩定在90℃、60℃、72℃附近的區域，并且可以循環控制[6]，所以這是PCR-CE芯片的外圍控制電路的設計核心，也是我們設計溫度控制電路的目的所在。

我們所設計的控制系統有三個部分組成，這其中包括硬件控制系統、優良的控制算法和良好的人機界面平臺。設計核心就是利用芯片的Pt金屬具有溫度-電阻特性，即電阻隨著溫度的變化呈線性變化規律，這樣利用相應的電路系統將Pt的實時電阻電阻值測出，并轉化為電壓信號，再利用輸入到計算機軟件中進行運算，根據運算結果實時轉化為溫度值與設定溫度值進行比對，高于設定溫度值則利用散熱片與風扇的雙重降溫機制對PCR-CE芯片降溫；而低于設定的溫度值則會輸出升溫信號給Pt電阻，利用電路對Pt電阻進行升溫控制[5]。

溫控系統的硬件系統主要包括了PC平臺、恒流源模塊、信號放大輸出模塊、風扇散熱片降溫模塊、電路加熱模塊和溫度感應模塊。

恒流源模塊即利用SX3002的5V恒壓源與HA5221高精度運算放大器組成一個恒流源，即運算放大器的一個輸入端加5V電壓，另一個輸入端加2kΩ的電阻，這樣便會輸出為2，5mA的電流，再將恒流源電路接入到Pt電極上，隨著Pt的溫度變化，阻值會發生線性變化，進而會在電路上輸出線性電壓信號。

由于軟件系統的測量與運算需要在一定范圍與精度內工作，因此硬件系統的電壓值也需要在一定范圍內測量，所以要設計信號放大模塊，信號放大模塊的芯片采用AD812高精度電流反饋放大器，AD620的放大倍數計算公式為A=1+49.4kΩ/R，根據電阻的規格，我們選用5K阻值的電阻，這樣根據計算放大倍數為10.9倍，這樣給軟件系統的輸出電壓值在3.27V左右變化，測量的精度提高到0.035℃的溫度檢測最小指標，溫度變化幅度為0.1℃以下，達到精確控制的要求。

加熱模塊是當Pt實測溫度值低于預設溫度值時開始工作，軟件系統便會發出信號驅動加熱模塊工作，使芯片能夠迅速加熱到預設溫度，加熱電路采用OPA603高電流運算放大器為核心芯片，將芯片與Pt加熱電極與軟件輸出接口OA0連接，當PCR腔室需要升溫的時候，軟件系統便會控制加熱電路通過Pt加熱電極對PCR腔室升溫，加熱模塊可以提供200mA電流，便可以迅速升高Pt電極溫度。

降溫模塊是當Pt實測溫度值高于預設溫度值時開始工作，軟件系統通過輸出接口OA1與另外一個OPA603連接，OPA603利用繼電器控制降溫裝置工作，由于風扇不能達到迅速降溫的目的，因此需要將風扇上放置制冷片進行雙層制冷。當需要降溫時，OPA603控制繼電器銜鐵吸合，進而風扇與制冷片電路導通工作，降低芯片的溫度到預設溫度。

將這幾個模塊搭建在一起變組成了PCR-CE芯片的溫度控制電路，圖5為溫度控制電路搭建的實物圖。

5.PCR-CE芯片的軟件控制平臺

軟件系統首先要通過溫度傳感電極收集Pt的電壓數據，根據在軟件系統內處理過的電壓-溫度曲線計算出實時溫度，再對比實時溫度與設定溫度之間的大小，進而利用軟件系統去控制硬件系統的加熱單元或者降溫單元對芯片進行加熱或者降溫處理，這是編寫軟件程序的最初思路。對于實驗人員來說不需要了解軟件系統如何去工作，而是要提供給工作人員一個簡單快捷方便的界面，通過了解界面所給出的曲線和物理量的數據進而調節數據達到控制PCR反應溫度的目的。

軟件控制平臺的搭建我們采用Labview人機開發系統，將Labview軟件平臺搭建在PC上，并用PIC總線與采集卡和PC進行通信，數據采集卡對硬件電路的電壓信號進行實時采集，并通過PIC總線傳送給PC的Labview系統，Labview系統的軟件通過采集的電壓信號進行實時處理。

其中軟件系統主要包括溫度電壓換算程序、預設溫度程序、PID調節控制程序等程序。

溫度電壓換算程序依據Pt電極的溫度感應特性，即存在著溫度與電阻的一種線性關系。這樣我們通過外圍的控制程序進而得到在每溫度變化0.1℃時對應的電阻值，在60-100℃區間內測量約為400組數據，這樣利用orgin8.0軟件采用最小二乘法，得到溫度與電阻的線性曲線，又因為我們采用恒流源，進而得到溫度與電壓之間的線性關系，為后續的控制提供了運算工具。圖6為擬合好的Pt電極的溫度電阻關系圖。

預設溫度程序是一個對比的標準，實驗中需要得到實時溫度值與預設溫度值進行對比，從而達到控制的目的。PCR反應需要在變性溫度為90℃，退火溫度為60 ℃，延伸溫度為72℃這三個溫度區內進行[7]，因此先預設這三個溫度點以及該溫度所需要持續的時間，再通過硬件系統以及外圍控制程序得到芯片的實際溫度，預設溫度在一個時間點確定它的時間范圍，實時溫度再與該時間點的預設溫度進行比較，便會得到需要加熱或者降溫的信號處理，利用后續的PID控制程序進行外圍的硬件系統的加熱或者降溫處理。

PID控制程序的主要目的是將實時溫度迅速提高或者降低為預設溫度，從而提高PCR合成的效率，因此PID控制程序是軟件系統的核心，也是整個PCR反應的溫度控制的核心。本實驗的輸出公式為[8]

根據PID控制原則，比例環節中的誤差值e為實時溫度與設定溫度之間的差值，微分環節的e1為本次的實時溫度與設定溫度的差值與上一次的實時溫度與設定溫度的差值之間的差值，積分環節的e2位以前所有的誤差值得綜合，這樣便能組成這樣的輸出公式。根據PID運算便能迅速的進行加熱與降溫工作[9]。

6.整體系統的搭建與檢測

待PCR-CE芯片、溫度控制電路系統與軟件系統研制成后，進行系統組裝，圖7為組裝完成的系統圖。

通過實驗證明，芯片的PDMS蓋片與Pt電極層鍵合性能良好，沒有出現液體側漏的情況，系統的溫度控制如預期一樣可以完成溫度控制，并且升溫速度可達到12℃/s，降溫速度可以達到5℃/s，完全達到PCR-CE實驗的性能指標。

7.結論

本文主要介紹了溫度控制的PCR-CE芯片的制作工藝、溫度控制電路的搭建以及軟件平臺的設計，完成了一個完整的PCR-CE溫度控制系統的建立，為后期進行PCR實驗與CE實驗提供了實驗平臺。同時系統還存在著一些不足的地方，即存在系統的集成化有待于提高，降溫的速度相對于升溫速度明顯偏低和芯片的生物親和性低等問題。

[1]陳文元,張衛平.集成式微流控聚合物PCR芯片[M].上海:上海交通大學出版社,2009.

[2]Eddings M A,Johnson M A,Gale B K.Determining the optimal PDMS-PDMS bonding technique for micro fl uidic devices[J].Journal of Micromechanics and Microengineeri ng,2008,18(6):067001.

[3]Young,S.S.Keunchang,C.Sun,H.PDMS-based micro PCR chip with Parylene coating,J.Micromech.Microeng(2003),13:768-774.

[4]Xia Y N,Whiteside G M.Soft Lithography.Annual Review of Materials Research,1998,28:84-153.

[5]Duffy,D.C.;McDonald,J.C.;Schueller,O.J.A.;Whitesides,G.M.;Anal.Chem.,Rapid Prototyping of Micro fl uidic Systems in Poly(dimethylsiloxane),1998,70,4974-4984.

[6]Lao AIK,Lee TMH,et al.Precise temperature control of micro fl uidic chamber for gas and liqiud phase reactions[J].Sensors and Actuators.2000,84:11-17.

[7]Mamdani E H.Application of fuzzy algorithms for control of simple dynamic plant[J].Proc.Inst Elect-Eng,1974.D-121:1585-1589.

[8]Dae-Sik Lee,Se Ho Park,Kwang Hyo Chung,and Hycon-Bong PYO,A Disposable Plastic-Sicon Micro PCR Chip Using Flexible Printed Circuit Board Protocols and ITS Application to Genomic DNA Amplification[J].IEEE Sensors Journal 2008,8(5):557-564.

[9]江偉,袁芳.Labview環境下溫度控制系統的設計[J].國外電子測量技術,2004(3):8-10.