丁香油放置過程中丁香酚含量變化及抗菌作用的研究

李巧如 歸巧娣 陜西省人民醫院（西安71068）

丁香油是桃金娘科植物丁香Syzygium aromaticum Merr.Perry（Eugeia caryophLLata Thumb.）的干燥花蕾，經水蒸氣蒸餾得到的揮發油。其中所含化學成分以丁香酚為主占（57～85%）、石竹烯（14.408%）、丁香酚乙酸酯（17.930%）［1］。丁香油對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、志賀痢疾桿菌、銅綠假單孢桿菌、腸炎沙門氏菌、枯草桿菌、產酸克雷伯菌、表皮葡萄球菌及部分深部真菌皆有明顯的抑制和殺滅作用［2－4］。但丁香油性質不穩定，隨著放置時間，顏色變黃，其中丁香酚含量變化如何以及其抗菌作用有何變化，未見文獻報道，本文就丁香油于溫度25±2℃，相對濕度60%±10%放置0、1、2、3、6、12個月，及溫度40±2℃，相對濕度75%±5%放置1、2、3個月后各丁香酚含量的變化及其對金黃色葡萄球菌等7種致病菌的抗菌強度（MIC）變化進行研究，結果報道如下。

1 儀器與試藥 1.1 儀器 島津10A－vp高效液相色譜儀：包括SPD－M10Avp二極管陣列檢測器、Shimadzu CLASS VP色譜工作站。Inertsil ODS C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）（日本株式會社）。電子天平（日本株式會社）。恒溫水浴鍋（北京長安科學儀器廠），真空干燥箱（天津市津北真空儀器廠），100μL微量加樣器（上海求精生化儀器廠），96孔培養板。

1.2 試藥 丁香油自制。丁香酚對照品（批號：725－200008）購于中國藥品生物制品檢定所。水為雙重蒸餾水，乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑為分析純。

1.3 菌株 金黃色葡萄球菌（ATCC25923）、大腸桿菌 （ATCC25922）、銅綠假單孢桿菌（ATCC27853）為標準菌株，購于衛生部臨床檢驗中心。表皮葡萄球菌（201103）、鮑蔓不動桿菌（201106），陰溝桿菌（201108），肺炎克雷伯菌（201101）由陜西省人民醫院檢驗科從臨床標本培養分離得到。

1.4 培養基 沙氏培養基，批號20110406；M－H瓊脂培養基，批號20110108；M－H 肉湯培養基，批號20110229，均系杭州微生物試劑有限公司產品，加0.3%的瓊脂制成半固體培養基。

2 方法與結果 取丁香油置4個磨口棕色瓶中，每瓶10mL，每2個分別置于溫度25℃±2℃，相對濕度60%±10%及溫度40℃±2℃，相對濕度75%±5%下保存，用高效液相法測定放置0、1、2、3、6、12個月后各丁香酚的含量；用微量瓊脂稀釋法測定其對金黃色葡萄球菌等7種致病菌的抗菌強度（MIC）。

2.1 丁香酚的含量測定 2.1.1 色譜條件：Inertsil ODS C18色譜柱；流動相：A 為乙腈，B為0.1%磷酸溶液，進行梯度洗脫，0～30min，A：45→70%；30～35min，A：70→95%；35～50min，A：95%；50～55min，A：95→45% 。檢測波長230nm；柱溫30℃；流速1mL·min－1。

2.1.2 對照品溶液的制備：精密吸取丁香酚對照品5.01mg至25mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，再從中精密吸取1mL至10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得，終濃度為20.04μg／mL。

2.1.3 供試品溶液的制備：精密吸取丁香油5.00mg至25mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，再從中精密吸取1mL至10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.1.4 線性關系考察：分別精密吸取丁香酚對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL置于10mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，配制成不同濃度的對照品溶液，按上述色譜條件測定。以丁香酚檢測濃度（X）為橫坐標，峰面積積分值（Y）為縱坐標，制備標準曲線，得回歸方程Y＝7E＋09X＋613166，r＝0.9991結果表明，丁香酚在0.2004～1.002μg范圍內與峰面積積分值呈良好的線性關系。

2.1.5 精密度試驗在上述色譜條件下精密吸取濃度為20.04μg／mL的丁香酚對照品溶液10μL，注入色譜儀，連續測定6次。結果RSD為0.80%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩定性試驗：取同一供試品溶液適量，分別于0，1，2，4，6，8h按上述色譜條件進樣測定。結果RSD為1.76%，表明供試品溶液在10h內穩定。

2.1.7 重復性試驗：取同一批樣品5份，分別按“2.1.3”項方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下測定，結果丁香酚RSD 為1.61%，表明方法重復性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗：精密吸取已知含量的樣品9份，分別精密加入一定量丁香酚對照品溶液混合均勻，按上述色譜條件測定，計算加樣回收率。

表1 加樣回收率實驗結果

2.1.9 丁香油放置不同時間丁香酚含量測定：取于溫度25±2℃，及40±2℃放置0、1、2、3、6、12個月的丁香油測定其中丁香酚含量，方法同前，見表2。

表2 丁香油放置不同時間丁香酚含量測定結果（n＝2）

實驗結果發現，丁香油中的丁香酚在兩種條件下保存，丁香酚均相對比較穩定。

2.2 丁香油放置不同時間抗菌試驗 2.2.1 藥物配制：精密吸取丁香油1.0mL，置10mL試管中，加入無菌0.1%瓊脂溶液6mL混勻。再精密吸取2mL用無菌生理鹽水溶液依次作2、4、8、32、64、128、256、512倍稀釋，即得不同濃度的丁香油溶液。

2.2.2 菌液的制備：用無菌槍頭挑取數個新鮮的金黃色葡萄球菌菌落于2mL營養肉湯管中，制成0.5麥氏比濁度的菌懸液，置37℃溫箱孵育2～3h，取50μL菌懸液加入10mL微量半固體培養基［2］中混勻，備用。其它菌株操作相同。

2.2.3 抗菌試驗：用微量瓊脂稀釋法，取96孔培養板每孔分別加入經倍比稀釋的丁香油溶液50μL再分別加入制備好的各菌液50μL，輕輕混勻，置37℃培養箱，培養24h，觀察結果。每個樣品濃度重復實驗1次。（見表3）

表3 丁香揮發油放置不同時間的體外抗菌試驗結果（稀釋倍數）

3 討 論 丁香酚含量測定有采用氣相色譜法［5］和液相色譜法［6］等方法，其中液相色譜法應用較普遍，本研究采用高效液相色譜法測定丁香油中丁香酚含量。通過對丁香酚標準品甲醇溶液在200～400nm進行掃描，發現其在230nm 有最大吸收，故選擇230nm 為檢測波長。對色譜條件中流動相系統進行了考察，發現用乙腈－0.1%磷酸溶液系統分離峰最好。丁香油中除丁香酚外，石竹烯和丁香酚乙酸酯含量也較大，為了更好地考察丁香油的穩定性，本研究最終確定用乙腈－0.1%磷酸溶液進行梯度洗脫，同時測定了石竹烯和丁香酚乙酸酯的峰面積積分值。觀察結果顯示，丁香油于溫度25±2℃放置12個月，及40±2℃放置3個月其中丁香酚含量變化不顯著，且丁香油中丁香酚比丁香酚標準品要穩定得多，是何原因有待深入研究（丁香烯峰面積變化不顯著，丁香酚乙酸酯峰面積在顯著減?。?，而丁香油的抗菌作用隨放置時間無明顯變化。

［1］ 陳邱琴，崔兆杰，韋棟梁，等.丁香揮發油化學成分的研究［J］.藥物分析雜志，2003，23（6）：443－446.

［2］ 李巧如，劉宗智，任健康，等.丁香提取物抗菌機理的探討［J］.西北藥學雜志，2001，16（6）：261－262.

［3］ 趙晨曦，梁逸曾，李曉寧.丁香揮發油化學成分與抗菌活性研究［J］.天然產物研究與開發，2006，18（3）：381－385.

［4］ 呂世民，陳杖榴，陳建新.丁香酚體外抗菌作用的研究［J］.食品科學，2008，29（9）：122－124.

［5］ 王海英.氣相色譜法測定丁香油中丁香酚含量［J］.哈爾濱醫藥，2009（29）：20－21.

［6］ 余小平.高效液相色譜法測定丁香中丁香酚的含量［J］.藥物分析雜志，2008，28（6）：975－977