芽孢桿菌活體微生物農藥研究現狀及應用

王 春，汪 琨，崔志峰

(浙江工業大學生物與環境工程學院，浙江杭州 310014)

農業生產每年都會因病蟲害而造成巨大損失。長期以來人們一直主要采用化學農藥控制農作物病蟲害，但化學農藥的3R問題 (殘留、再增猖獗、抗性)已引起越來越多的關注。目前在生物農藥中，微生物活體農藥已占有舉足輕重的地位，特別是現代微生物技術等新的研究開發手段應用于微生物農藥領域，大大促進了活體微生物農藥的開發。

芽孢桿菌不僅能產生抗菌物質，且具有抗逆性、耐高溫、易貯存等生物學特性，分布廣泛，對人畜無毒無害，不污染環境，是一種理想的生防微生物［1］。近年來，芽孢桿菌的生態、生理和防病作用以及在農業領域中的巨大應用潛力，已逐漸成為國內外研究的熱點。

1 芽孢桿菌殺蟲劑

全世界已有30多個國家的100多家公司共生產出150多個品種的細菌殺蟲劑［2］，制成產品并廣泛應用的主要有蘇云金芽孢桿菌 (B．thuringiensist)、日本金龜子芽孢桿菌、球形芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌4種［3］，其中蘇云金芽孢桿菌是當今研究最多的殺蟲細菌，其制劑被用來防治150多種害蟲 (主要是鱗翅目害蟲)。

1.1 蘇云金芽孢桿菌

蘇云金芽孢桿菌是一種廣泛存在的產芽孢的革蘭氏陽性菌，主要有庫斯塔克、日本、擬步甲和以色列4個亞種。在孢子形成過程中，產生伴孢晶體、朊蛋白和晶體包含體。蘇云金芽孢桿菌的殺蟲活性成分主要是其在生長過程中產生的不同類型的殺蟲晶體蛋白 (insecticidal crystal protein，ICP)。目前，已經找出了數十種生物殺蟲活性成分，胞外因子有酶類:幾丁質酶，磷脂酶C，溶血素，VIP殺蟲蛋白;醇類:雙效菌素;核苷類:蘇云金素。胞內因子有蛋白質:殺蟲晶體蛋白，免疫抑制因子A，腸毒素;芽孢:活芽孢［4］。除了產生內毒素，許多蘇云金芽孢桿菌本身對昆蟲來說也是很強的致病菌。已經分離得到蘇云金芽孢桿菌許多與ICP有關的基因，經過修剪并將其導入作物中，使作物本身也具有殺蟲能力。例如孟山都公司將蘇云金芽孢桿菌kurstaki亞種的cry1A(c)基因轉入棉花和番茄中［5］。

蘇云金芽孢桿菌菌系的研究主要在2個方面，一是尋找自然存在的蘇云金芽孢桿菌新菌系;二是利用分子生物學技術將已確定的蘇云金芽孢桿菌菌系進行改造，研發殺蟲活性更高、防治譜更廣的生防菌［6］。利用分子生物學技術對篩選的蘇云金芽孢桿菌菌株進行質粒轉移，拓寬殺蟲譜。例如Crickmore等［7］將具鞘翅目活性的cry3A基因導入以色列亞種后，重組菌株不僅增加了對鞘翅目昆蟲的毒性，還產生對鱗翅目大菜粉蝶的毒性。通過改造ICP基因結構，提高毒蛋白活性。美國Sandoz公司通過改變蘇云金芽孢桿菌的wuhanensis亞種的毒蛋白氨基酸組成，使殺蟲毒性提高了2～3倍。在構建蘇云金芽孢桿菌基因工程菌時，增加ICP基因拷貝數可以提高ICP基因表達量。利用輔助蛋白的增效作用，也可以增加ICP晶體蛋白的表達量。Wu等［8］最早注意到27 Ku蛋白能提高65 Ku及130 Ku蛋白殺蚊毒力。Adams等［9］研究也表明，存在于cry4D操縱子中的20 Ku蛋白能顯著增加cryA在大腸桿菌中的表達量。另外還可通過增加ICP基因拷貝數和對啟動子結構改造來提高ICP晶體蛋白的表達量，提高殺蟲能力。

1.2 球形芽孢桿菌

球形芽孢桿菌是一種嚴格需氧微生物，其殺蟲譜比蘇云金芽孢桿菌窄，一般僅對蚊蟲有毒性。在球形芽孢桿菌中發現有2類不同的殺蟲毒素，一類是二元毒素 (Bin毒素)，另一類是殺蚊毒素 (Mtx毒素)［10］。由于球形芽孢桿菌的芽孢和晶體在環境中持效期長，并有可能在環境中再循環，適用于防治污水中的淡色庫蚊和致倦庫蚊，因此，對球形芽孢桿菌高毒菌株的篩選受到廣泛重視［11］。迄今，美國、法國和中國等多個國家研制了其液劑、乳劑和粉劑等10余種產品。到目前為止，中國每年生產球形芽孢桿菌實驗制劑在150 t左右，每年應用面積2 000 hm2以上，已成為世界上球形芽孢桿菌生產量最大、應用最廣、應用效果最佳的國家。2001年，中國第一個利用球形芽孢桿菌C3-41研制的殺蚊商品制劑 (康寶)已獲批準生產和應用［12］。

對球形芽孢桿菌的研究主要利用分子生物學技術來提高持效期、擴大殺蚊普。山東省寄生蟲病防治研究所構建了一株基因工程藻類，把含有球形芽孢桿菌蛋白基因穿梭質粒轉入魚腥藻 (pDc26)中，當工程藻細胞的濃度在6.0×105個·mL-1以上時，48 h可殺死99%～100%蚊幼蟲。連續觀察2個多月，該基因工程藻仍有明顯的殺蚊效果，比單獨使用球形芽孢桿菌效果更好［13］。

1.3 日本金龜子芽孢桿菌

金龜子芽孢桿菌主要通過芽孢感染和傳播，在幼蟲消化道內萌發成桿狀營養細胞，營養細胞通過吞噬作用進入中腸細胞。金龜子芽孢桿菌在普通培養基上很難生長，在特殊培養基上雖可進行營養生長，但產芽孢仍然受到限制;在離體情況下，即使產生芽孢，這種芽孢毒力也比幼蟲體內產生的芽孢毒力大大降低。緩死芽孢桿菌的培養條件比金龜子芽孢桿菌的更加苛刻，均為專性寄生菌，在自然界發病率較高，具有潛在的應用價值。目前日本金龜子芽孢桿菌孢子粉只能通過活體金龜子幼蟲進行繁殖［14］。目前，僅有2家美國公司生產和出售日本金龜子芽孢桿菌制劑，分別是Fairfax生物實驗室生產的制劑Doom和Japidemic，Rruter實驗室生產的制劑 Milk-Spore［13］。

1.4 其他殺蟲芽孢桿菌

青蟲菌和殺螟桿菌都是好氣性蠟狀芽孢桿菌。青蟲菌屬低毒殺蟲劑，對害蟲具有胃毒作用，而對蜜蜂和昆蟲天敵無害，能夠對蔬菜、水稻等害蟲進行有效防治。殺螟桿菌是從中國感病稻螟蟲尸體內分離得到的，主要防治水稻、玉米、蔬菜、茶葉等作物的鱗翅目害蟲。另外，日本研制的森田芽孢桿菌制劑Labillus，主要用于衛生害蟲的防治，將其拌入雞飼料中，可抑制96%～99%的家蠅成蟲羽化［15］。徐婉學等［16］報道了側孢芽孢桿菌 AS1.864菌株對三帶喙庫蚊、尖音庫蚊、白紋伊蚊等具有殺蟲活性。還有一些昆蟲病原芽孢桿菌，如蠟狀芽孢桿菌、幼蟲芽孢桿菌、側孢芽孢桿菌等。另縮短梭菌和天幕蟲梭菌通過昆蟲體培養制備的菌劑可用于一些毒蛾類幼蟲的防治。

2 芽孢桿菌殺菌劑

芽孢桿菌是土壤和植物微生態的優勢微生物種群，具有很強的抗逆能力和抗菌防病作用，許多性狀優良的天然分離株已成功地應用于植物病害的生物防治。芽孢桿菌可防治棉花枯萎病、小麥全蝕病、稻瘟病、葉枯病、黃瓜苗期猝倒病、馬鈴薯瘡痂病、蔬菜苗期立枯絲核菌、菠菜枯萎病、小麥赤霉病、蘋果紅癌病、小麥根腐病、蘋果輪紋病等多種植物病害［17］。目前芽孢桿菌活體殺菌劑商品不多［18-19］(表1-2)，但發展潛力巨大，主要集中在芽孢桿菌對植物病害防治上的應用。

2.1 枯草芽孢桿菌

美國已有 GB03、MB1600、QST713和 FZB244株枯草芽孢桿菌生防菌獲得環保局商品化生產應用許可［20］。澳大利亞開發的B．subtilis A-13對麥類和胡蘿卜的立枯病以及其他土傳病害具有很好的防效，并對作物有一定的增產作用［21］。日本東京技術研究所的 B．subtilis RB14和 B.subtilis NB22分別對Rhizoctonia solani、Fusarium oxysporum 和 Pseudomonas solanacearum引起的番茄病害有良好的防效［22］。

中國已開發出一批生物防治作用優良的枯草芽孢桿菌菌株 (如 B916，B908，B3，B903，BL03，XM16)、蠟樣芽孢桿菌 R2、短小芽孢桿菌(Bacillus pumillus)A3和增產菌系列。江蘇農科院植保所開發的B.subtilis B916已進行農藥登記，對水稻紋枯病田間防效持續10年穩定在50%～80%［23］;南京農業大學分離的B.subtilis B3，商品名為麥豐寧，對小麥紋枯病田間防效達50%～80%;劉穎等［24］分離的B.subtilis TG-26和林福星等［25］分離的 Bacillus spp.Xh222、B.subtilis B034對不同的病原菌有強烈的抑制作用;林東等［26］分離的枯草芽孢桿菌S-0113對Trichothecium roseum、Fusarium spp.等抑制效果達到100%;辛玉成等［27］分離得到的枯草芽孢桿菌CN620菌劑對Glomerellaso、Alernaria、Trichothercium、Roserm、Pesutalotia spp．5種板栗爛果病的抑制作用均達到100%;李宏科等［28］研究發現，生防菌 BS-98能強烈抑制Physalaspora prioicola、蘆葦枯萎病菌等植物致病菌。

表1 芽孢桿菌活體殺菌劑主要產品

2.2 其他殺菌芽孢桿菌

崔云龍等［29］研究表明，短小芽孢桿菌D82對小麥根腐病有強抗生作用;王靜等［30］報道，短小芽孢桿菌AR03菌體和發酵液對煙草黑脛病菌具有拮抗活性，AR03對煙草黑脛病菌和青枯病具有可持續控病作用;連玲麗等［31］報道，短小芽孢桿菌EN16可以誘導番茄對細菌性青枯病的抗性;紀兆林等［32-33］試驗研究發現，地衣芽孢桿菌W10、多粘類芽孢桿菌W3和多粘類芽孢桿菌Y2對蘋果輪紋病菌、柑橘炭疽病菌和柑橘青霉病菌有明顯的抑制作用，其中W10菌株的抑制最強，不僅抑制病菌菌絲生長，破壞菌絲細胞，還能抑制病菌分生孢子的產生和芽管的伸長。

果實離體試驗表明，地衣芽孢桿菌W10可延遲果實腐爛，降低果腐率，抑制病斑擴展。因此，地衣芽孢桿菌W10在水果采后病害的防治上具有較大的應用潛力。彭化賢等［34］從水稻根部分離篩選得到一株地衣芽孢桿菌，其對稻瘟病菌具有較強的抑制作用，通過連續2年的田間防效病果測試，防效均在50%以上。Sid Ahemd［35］通過試驗發現，地衣芽孢桿菌可增強角素抑制辣椒根腐病的活性?？梢?，地衣芽孢桿菌除了對一些植物致病菌有拮抗活性外，還對某些藥劑具有一定增效作用。

趙德立等［36］報道，多粘芽孢桿菌JW-725對柑橘青霉具有很強的抑制作用;王笑穎等［37］篩選得到一株對大麗輪枝菌具有較強拮抗活性的多粘芽孢桿菌7-4，對棉花黃萎病具有良好的防效。由此可見，多粘芽孢桿菌在生物防治方面也具有重要的研究價值。另外，像蠟質芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和堅強芽孢桿菌等也有報道表明具有良好的生物防效。劉貫鋒［38］對芽孢桿菌分類學和生防功能菌的篩選研究表明，共有11株芽孢桿菌對青枯雷氏爾菌有拮抗作用;對大腸桿菌有拮抗作用的菌株也為11株;另篩選出對香蕉枯萎病菌有拮抗作用的芽孢桿菌16株。因此，芽孢桿菌生物防治具有巨大的研究和應用價值。

表2 美國EPA已登記注冊的芽孢桿菌

3 小結與展望

隨著一些化學農藥逐漸被禁止使用和生產，微生物農藥逐漸占據應用市場，芽孢桿菌作為活體農藥防治植物病蟲害的巨大潛能正日益受到人們的高度關注。與傳統農藥相比，生物農藥的風險較低。美國是生物農藥登記最多的國家，美國環保局(EPA)公布了已登記注冊的芽孢桿菌數達到28種［39-40］，占總的生物農藥的8.78%，未來這一比重將逐漸增大。

芽孢桿菌作為殺蟲劑已經取得了一定的成功，但目前所占市場份額不足1%，主要是由于存在一些不足之處，例如殺蟲譜窄，不能對在作物內部取食的害蟲起作用;環境因素的影響，持效期短;易受其他微生物的作用而失效等。不過這也為改進活體殺蟲劑起到了指示作用。

生物防治植物病害，芽孢桿菌無疑是研究和應用最多的。目前，芽孢桿菌拮抗基因的分離克隆、表達調控和遺傳改良等研究已在國內外引起了高度的重視，芽孢桿菌作為活體農藥展示了美好的前景?，F在對活體農藥的研究范圍還不是十分廣泛，迫切需要拓展新的研究方向。隨著現代遺傳工程技術的發展和環保觀念的深入人心，芽孢桿菌作為活體農藥將逐步替代傳統化學農藥。

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