刺五加多糖對斷奶仔豬外周血淋巴細胞信號傳導的影響

韓 杰，邊連全，劉顯軍，張 飛

沈陽農業大學畜牧獸醫學院，沈陽 110866

受免疫系統尚未發育成熟以及斷奶引發的斷奶應激的影響，仔豬特別容易受到環境中病原微生物的侵襲而發生免疫應激，免疫應激使仔豬在行為上表現為嗜睡、采食量減少;代謝上則使機體將用于生長的營養物質轉向用于參與免疫防御，最終導致仔豬出現生長抑制［1］。由于長期添加抗生素促生長劑引發的畜禽產品安全和人體健康等問題，禁止在畜禽生產中使用抗生素的呼聲越來越高，開發綠色環保型飼料添加劑具有重要意義。刺五加多糖(Acanthopanax senticosuspolysaccharide，ASPS)是從傳統中草藥刺五加中分離出的生物大分子多糖，其在體內、外對人類和嚙齒類動物的免疫調節活性已經被一些研究所證實。但在斷奶仔豬飼料中添加ASPS調節仔豬生長和免疫功能的研究鮮有報道。我們課題組前期的研究表明飼料添加ASPS 能緩解免疫應激仔豬的生長抑制，改善斷奶仔豬的免疫機能［2］，但ASPS 調解斷奶仔豬免疫功能的作用機制尚不清楚。本試驗在前期研究基礎上，通過體外培養仔豬外周血淋巴細胞，從淋巴細胞內信號傳導的角度初步探討ASPS 影響仔豬免疫功能的作用機制，旨在為ASPS 這種綠色飼料添加劑在養豬生產上的應用提供理論參考資料。

1 材料與方法

1.1 不同濃度刺五加多糖溶液的配制

取刺五加根，采用熱水浸提乙醇分級沉淀工藝提取，苯酚-硫酸法測得多糖純度為92.7%。氣相色譜表明該多糖主要由葡萄糖和半乳糖組成。稱取320 mg ASPS 溶解于適量含10%胎牛血清的RPMI-1640 完全培養液中，用5% NaHCO3調pH 至7.2～7.4，定容至100 mL 容量瓶中，0.22 μm 濾器過濾除菌，配制成含3.2 mg/mL ASPS RPMI-1640 細胞培養液，于4 ℃保存備用。臨用前取1 mL 上述ASPS 細胞培養液，用含10%胎牛血清的RPMI-1640 完全培養液分別稀釋至8、4、2、1 mL，配制成濃度分別為400、800、1600、3200 μg/mL ASPS 細胞培養液。

1.2 體外培養細胞的來源

取自1 頭28 d 斷奶、體重約8 kg 的健康仔豬的外周血。

1.3 外周血淋巴細胞懸液的制備及T、B 淋巴細胞的分離

取2 mL 肝素抗凝全血與生理鹽水1∶1 混勻后，緩緩加入4 mL 淋巴細胞分離液，2000 rpm 離心20 min，取乳白色淋巴細胞層約0.6 mL，加入5 mL RPMI-1640 完全培養液混勻，2000 rpm 離心20 min，沉淀經2 次離心洗滌后即得所需的淋巴細胞。將細胞懸浮于RPMI-1640 完全培養液中，用0.5%臺盼藍染色計數活細胞數(＞95%)，調整細胞濃度為1 ×106個/mL。T、B 淋巴細胞的分離參照高巍等(2007)方法［3］。

1.4 測定指標

1.4.1 淋巴細胞增殖試驗

取0.08 mL T 細胞懸液含Con A(終濃度為5 mg/L)或B 細胞懸液含LPS(終濃度為20 mg/L)，加入到96 孔平底培養板中，再加入預先稀釋成不同濃度的ASPS 溶液0.01 mL、RPMI-1640 完全培養液0.01 mL，使培養體系ASPS 終濃度分別為0、40、80、160、320 μg/mL，每組設5 個重復。將細胞板置于5%、37 ℃CO2培養箱培養72 h。培養結束前6 h，每孔加入10 μL MTT(初始濃度為5 mg/mL)繼續培養。結束每孔加入80 μL 10% SDS-0.04 mol/L HCl溶液再培養2 h，使紫色結晶完全溶解，酶聯免疫檢測儀測定570 nm 波長OD 值。

1.4.2 白細胞介素-2(IL-2) 和白細胞介素-4(IL-4)的測定

將淋巴細胞懸液進行細胞培養，步驟同1.4.1淋巴細胞增殖試驗，在培養的第24、48 和72 h，取上清液用IL-2 和IL-4 試劑盒(美國R＆D)測定。

1.4.3 T 淋巴細胞分泌可誘導一氧化氮合成酶(iNOS) 水平測定

96 孔平底培養板中每孔加入含Con A(終濃度為5 mg/L)的T 細胞懸液0.08 mL、0.01 mL anti-TLR4(初始濃度為50 μg/mL)，孵育1 h 后加入不同濃度ASPS 溶液0.01 mL，使培養體系ASPS 終濃度分別為0、40、80、160、320 μg/mL，置細胞板于5%CO2，37 ℃培養箱中培養6 h，取上清液用iNOS 試劑盒(美國R＆D)測定，嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.4.4 淋巴細胞分泌NO 的測定

細胞培養同1.4.3，37 ℃培養箱中培養24 h，取50 μL 上清液加入等體積Greiss 試劑反應20 min，測定550 nm OD 值。將6.9 mg NaNO2溶于1000 mL 雙蒸水中，分別取200、160、120、80、40、20、10、0 μL 于酶標板中，再對應分別加入0、40、80、120、160、180、190、200 μL Greiss 試劑反應20 min 后測定550 nm OD 值。以OD 值為縱坐標，濃度為橫坐標做標準曲線。

1.4.5 核轉錄因子(NF-κB) 活性和腫瘤壞死因子α(TNF-α) 的測定

細胞板加樣同iNOS 的測定，將加樣后的細胞板置于5% CO2，37 ℃培養箱中培養72 h，測定采用NF-κB 和TNF-α 試劑盒(美國R＆D)。

1.5 數據統計分析

數據經Excel 初步處理后，采用SPSS 13.0 統計軟件的ANOVA 進行不同處理間的單因素方差分析，采用Ducan 法進行多重比較檢驗，以P＜0.05為顯著性標準。

2 結果與分析

2.1 刺五加多糖對外周血淋巴細胞轉化率的影響

由圖1 可知，ASPS 顯著提高了仔豬外周血T 淋巴細胞轉化率(P＜0.05)。與對照組相比，較高劑量的ASPS(160、320 μg/mL)顯著促進了T 淋巴細胞轉化率(P＜0.05)，而低劑量的ASPS(40、80 μg/mL)對T 淋巴細胞轉化率無顯著影響(P＞0.05);不同濃度的ASPS 對體外培養的仔豬外周血B 淋巴細胞轉化率均無顯著影響(P＞0.05)。

圖1 刺五加多糖對體外培養的仔豬外周血淋巴細胞轉化率的影響(n=5)Fig.1 Effect of ASPS on lymphocytes proliferation of cultured peripheral blood of weaned pigs (n=5)

2.2 刺五加多糖對淋巴細胞分泌IL-2 和IL-4 水平的影響

由表1 可知，在作用第24 和48 h，ASPS 處理雖使仔豬外周血淋巴細胞IL-2 產生量顯著增加(P＜0.05)，但與對照組相比，只有160 μg/mL 和320 μg/mL ASPS 處理組達到了顯著水平(P＜0.05);在作用第72 h 時，ASPS 處理顯著提高了淋巴細胞IL-2 的分泌量，并呈二次的劑量依賴關系(P＜0.05)。在作用第24、48 和72 h，ASPS 處理對體外培養的仔豬外周血淋巴細胞分泌IL-4 的影響均不顯著(P＞0.05)。

表1 刺五加多糖對體外培養的仔豬外周血淋巴細胞分泌IL-2 和IL-4 的影響(n=5)Table 1 Effect of ASPS on the concentration of IL-2 and IL-4 secreted by cultured peripheral blood lymphocytes of weaned pigs (n=5)

2.3 刺五加多糖對淋巴細胞分泌TNF-α、NO、iNOS和NF-κB 水平的影響

由表2 可知，當培養體系無TLR4 抗體時，ASPS處理對淋巴細胞分泌TNF-α、NO、iNOS 和NF-κB 水平有顯著影響(P＜0.05)。與對照組比較，40、80、160、320 μg/mL ASPS 處理顯著提高了淋巴細胞分泌iNOS 水平(P＜0.05)，160 μg/mL ASPS 組仔豬外周血淋巴細胞iNOS 分泌量最高。40、80、160 μg/mL ASPS 顯著增加了淋巴細胞NF-κB 分泌水平(P＜0.05)。80、160 μg/mL ASPS 顯著增加了淋巴細胞分泌TNF-α 的水平(P＜0.05)。當培養體系含TLR4 抗體時，不同濃度ASPS 對淋巴細胞TNF-α、iNOS 和NF-κB 的分泌量均無顯著影響(P＞0.05)。

表2 刺五加多糖對體外培養的仔豬外周血淋巴細胞分泌iNOS、NO、NF-κB 和TNF-α 水平的影響(n=5)Table 2 Effect of ASPS on the concentration of iNOS，NO，NF-κB and TNF-α secreted by cultured peripheral blood lymphocytes of weaned pigs (n=5)

3 討論

淋巴細胞增殖是檢測淋巴細胞免疫功能的常用指標之一，T 細胞受促分裂素Con A 刺激或B 細胞受LPS 刺激時的增殖情況在一定程度上可以分別反映細胞免疫和體液免疫的功能變化。本試驗結果發現ASPS 能協同Con A 促進外周血T 細胞增殖但不能協同LPS 促進B 細胞增殖，提示T 細胞可能是ASPS 作用的直接靶細胞之一。輔助性T 細胞(Th)作為T 細胞重要的亞型之一，其Th1 型細胞分泌的細胞因子IL-2 能有效促進T 淋巴細胞增殖、刺激細胞免疫和介導炎癥反應;Th2 型細胞產生的IL-4 可促進B 細胞增殖，刺激體液免疫，誘導抗體產生［4］。本研究發現ASPS 能促進Thl 型細胞因子IL-2 的分泌而對Th2 型細胞因子IL-4 分泌無影響，此結果與以往曹麗等(2004)［5］和楊鐵虹等(2005)［6］的報道相似，提示了ASPS 可能通過作用于T 細胞分泌IL-2 影響機體的細胞免疫功能。

NO 由淋巴細胞內可誘導iNOS 催化生成，是在調節免疫功能上具有廣泛生物活性的信息分子。以往很多關于多糖影響iNOS 的報道表明多糖能促進iNOS 基因表達，提高iNOS 活性進而促進NO 分泌，多糖提高iNOS 活性可能與激活NF-κB 因子有關［7］。侯敢等(2006)報道了蘆薈多糖能促進小鼠Mφ NO 合成酶基因的表達，促進NO 合成，用NF-κB抑制劑預先處理細胞，可抑制蘆薈多糖誘導的iNOS酶基因表達，表明蘆薈多糖促進的NOS 基因表達與NF-κB 因子的激活有關［8］。本試驗表明，ASPS 顯著提高了體外培養的外周血淋巴細胞內iNOS 水平、NO 分泌量和NF-κB 因子水平，160 μg/mL ASPS 組這些指標的水平均為最高，提示NO 可能是ASPS 作用于仔豬外周血淋巴細胞的信息分子，同時，ASPS提高iNOS 水平可能與激活NF-κB 因子有關。

以往研究已經證明了多糖調節免疫功能是通過首先與細胞表面受體結合介導免疫反應［9］。TLR4受體是Toll 受體超家族中最早被發現的成員之一，多糖受TLR4 受體介導通過信號分子將胞外信號傳導至胞內，使NF-κB 迅速從胞漿移位到胞核促進細胞因子釋放，從而調節免疫功能［10］。Yoon 等(2003)在研究桔梗根多糖時發現TLR4 抗體預先與Mφ 作用能使NF-κB 迅速從胞漿移位到胞核與DNA結合，提示桔梗根多糖通過TLR4/NF-κB 通路起作用［9］。本試驗同Yoon 等(2003)的試驗結果相似。從本試驗結果看，培養體系中無TLR4 抗體時，淋巴細胞分泌TNF-α、NO、iNOS 和NF-κB 因子水平均顯著升高，但這種作用在培養體系中含TLR4 抗體時被抑制，提示TLR4 可能是ASPS 作用于淋巴細胞表面的受體之一，ASPS 通過TLR4 受體介導由NO 將細胞外信號傳導至細胞內，從而調節NF-κB 因子活性而促進細胞因子TNF-α 的釋放，ASPS 影響淋巴細胞免疫功能與TLR4/NF-κB 信號傳導系統密不可分。

綜上所述，ASPS 能促進體外培養的仔豬外周血T 細胞增殖和IL-2 的分泌，其作用可能是受到淋巴細胞表面受體TLR4 介導，通過TLR4/NF-κB 信號通路起作用。

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