類胡蘿卜素在癸酸反膠束溶液中的電子吸收光譜特征變化

黃 金，惠伯棣,*，蔡 靳，宮 平，關 欣

（1.北京聯合大學應用文理學院，北京 100191；2.河北大學生命科學學院，河北 保定 071002）

類胡蘿卜素在癸酸反膠束溶液中的電子吸收光譜特征變化

黃 金1，惠伯棣1,*，蔡 靳2，宮 平1，關 欣1

（1.北京聯合大學應用文理學院，北京 100191；2.河北大學生命科學學院，河北 保定 071002）

采集3種類胡蘿卜素在癸酸反膠束溶液中的電子吸收光譜，進行特征分析。用四氫呋喃、丙酮和乙醇3種組裝助劑分別構建癸酸反膠束溶液，番茄紅素（開環碳氫化合物）、β-胡蘿卜素（具環碳氫化合物）和玉米黃素（具環羥基化合物）分別溶解在其中后，采集各溶液在300～550 nm波長范圍內的電子吸收光譜，分析其特征。結果表明：與3種類胡蘿卜素在癸酸中的光譜特征相比，它們在癸酸反膠束溶液中的最大吸收波長（λmax）均有微小位移；具環類胡蘿卜素的λmax發生紅移，開環胡蘿卜素的λmax發生紫移；同時，助劑極性的增強可使三者的吸光系數（A1%1cm）減小。

癸酸；反膠束溶液；電子吸收光譜；番茄紅素；β-胡蘿卜素；玉米黃素v

類胡蘿卜素（carotenoid）是一類細胞次生代謝產物的總稱。類胡蘿卜素對人類健康所產生的積極影響，其研究層面從分子水平到生物體水平，早已獲得大量實驗數據支持；其已知的生物學功能包括：清除體內自由基、調節免疫、保障眼健康、抑制腫瘤或癌、防治心血管疾病等。這也促使在該研究領域的基礎工作中，對類胡蘿卜素的生物學功能與其分子結構二者之間的關系進行更多討論。

電子吸收光譜主要產生于分子價電子能級間的躍遷。它不僅在有機化合物的結構鑒定中發揮重要作用，而且依此原理的建立紫外-可見分光光度法是應用最廣泛的定量分析方法之一。類胡蘿卜素分子中的多個共軛雙烯結構使其在可見光區的400～500 nm段有很強的吸收帶。由于通過對電子吸收光譜其位置、峰型和精細結構進行分析能夠得到相當豐富的分子結構信息，并且檢測方法操作簡便、檢測結果穩定可靠；因此測定類胡蘿卜素的電子吸收光譜已經成為其基礎研究工作中最基本的實驗手段。

癸酸反膠束溶液在類胡蘿卜素研究工作中最早應用于在新鮮魚肉組織中對蝦青素與斑螯黃素等酮基類胡蘿卜素的萃取[1]。癸酸反膠束溶液體系中主要的構件分子是癸酸（十碳烷酸，又名羊脂酸，其分子式為CH3（CH2）8CO（OH），相對分子質量為172.27），其羧酸基團具有極性，其烷基鏈具有非極性，分子具有兩親性質，在乙醇、丙酮、四氫呋喃等強極性有機試劑中可溶解并被裝成反膠束聚集體，這些強極性有機試劑即充當組裝助劑，在癸酸形成反膠束溶液（圖1）的過程中，癸酸分子在極性有機試劑的作用下形成反膠束，羧酸基團向內，烷烴鏈向外（即連續相）。當癸酸反膠束聚集體處于酸性水環境中，其反膠束聚集結構趨于穩定，最終形成癸酸反膠束溶液，又稱癸酸超分子溶液，能夠使癸酸反膠束溶液中由烷烴鏈外翻構成的連續相與水環境分離[2-7]。由于癸酸分子烷基鏈的非極性，使得癸酸反膠束溶液體系對類胡蘿卜素具有良好的溶解性，這對于使用有機試劑萃取類胡蘿卜素類化合物的傳統方法來說雖然并不具有優勢；但是由于其具有能夠與水環境分離的性質，這使得在處理新鮮魚肉等這類高含水量樣品時，既能高效萃取類胡蘿卜素，又能將樣品中的水排除在癸酸反膠束溶液體系之外，這就避免出現類胡蘿卜素在有機試劑萃取時由于干燥物料或是萃取液從含水極性有機相向不含水的有機相轉移的過程中的損失。此外，應用癸酸反膠束溶液減少了傳統有機試劑的使用，實驗方法更為環保。

圖1 癸酸反膠束溶液的結構示意圖Fig.1 Structure diagram of decanoic acid reverse micelles

目前，由于類胡蘿卜素在癸酸反膠束溶液中的電子吸收光譜特征數據的缺乏，直接從癸酸反膠束溶液中獲得類胡蘿卜素電子吸收光譜并根據其對類胡蘿卜素進行定性、定量檢測的方法未被建立起來。在多數情況下，樣品中的類胡蘿卜素在被癸酸反膠束溶液萃取后仍被轉移到有機溶劑中進行測定。因此，本項研究的目的注重于收集番茄紅素（開環碳氫化合物）、β-胡蘿卜素（具環碳氫化合物）和玉米黃素（具環羥基碳氫化合物）這3種分子結構上具有代表性的類胡蘿卜素（分子結構見圖2）在癸酸反膠束溶液中的電子吸收光譜數據，分析其光譜特征的變化規律（光譜特征包括吸光系數（）、最大吸收波長（λmax）、峰型與精細結構（VⅢ/VⅡ）值），為建立類胡蘿卜素在癸酸反膠束溶液的光譜檢測方法提供有價值的參考。

圖2 番茄紅素（a）、β--胡蘿卜素（b）和玉米黃素（c）的分子結構Fig.2 Molecular structures of lycopene (a), β-carotene (b) and zeaxanthin (c)

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

番茄紅素由華北制藥集團有限責任公司提供，樣品經C18-高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）方法測定[8]，番茄紅素含量＞99%；經C30-HPLC方法測定[9]，其全反式異構體含量＞99%。β-胡蘿卜素由浙江醫藥股份有限公司新昌制藥廠提供，樣品經C18-HPLC方法測定[10]，β-胡蘿卜素含量＞99%。玉米黃素由北京聯合大學應用文理學院食品科學系惠伯棣教授實驗室提供，樣品經C18-HPLC方法測定，玉米黃素含量＞99%。

癸酸 國藥集團化學試劑有限公司；鹽酸、四氫呋喃、乙醇、丙酮、二氯甲烷、石油醚（沸點：60～90℃） 北京化學試劑廠；娃哈哈純凈水購自本地超市。

1.2 儀器與設備

Multi Spec-1501紫外-可見光分光光度計 日本島津公司；TP114電子天平（0.0001g） 美國Denver Instrument公司；HH SHII-Ni恒溫水浴 北京長風儀器儀表有限公司。1.3 方法

1.3.1 癸酸反膠束溶液的制備

1.3.1.1 四氫呋喃-癸酸反膠束溶液的制備

在500 mL三角瓶中，稱取癸酸30 g，在35℃條件下溶解到20 mL四氫呋喃中。攪拌5 min后加入400 mL 10 mmol/L鹽酸水溶液。振蕩5 min后，轉移至1 000 mL分液漏斗中。靜置5 min。待分層后，收集上相液。在35℃條件下，一般可獲得上相液35 mL。取15 mL上相液分別置于3支10 mL具塞刻度試管中，每管5 mL，待用。

1.3.1.2 丙酮-癸酸反膠束溶液的制備

同1.3.1.1節。用丙酮替換四氫呋喃。在35℃條件下，一般可獲得30 mL上相液。

1.3.1.3 乙醇-癸酸反膠束溶液的制備

同1.3.1.1節。用乙醇替換四氫呋喃。在35℃條件下，一般可獲得25 mL上相液。

1.3.2 類胡蘿卜素儲備液的配制

1.3.2.1 番茄紅素儲備液的配制

準確（至0.0001g）稱取1mg番茄紅素晶體于25mL棕色容量瓶中。加入5～6滴二氯甲烷，將晶體溶解。用石油醚定容。

1.3.2.2 β-胡蘿卜素儲備液的配制

準確（至0.000 1 g）稱取1mg β-胡蘿卜素晶體于25 mL棕色容量瓶中。加入少量正己烷，振蕩，將晶體溶解。用石油醚定容。

1.3.2.3 玉米黃素儲備液的配制

準確（至0.000 1 g）稱取1 mg玉米黃素晶體于25 mL棕色容量瓶中。加入少量丙酮，振蕩，將晶體溶解。用丙酮定容。

1.3.3 電子吸收光譜采集

1.3.3.1 3種類胡蘿卜素在癸酸中電子吸收光譜的采集

取10 mL具塞刻度試管3支，每只分別加入5 mL癸酸（35℃預熱）。第1支中加入0.2 mL的番茄紅素儲備液，第2支中加入0.2 mL的β-胡蘿卜素儲備液，第3支中加入0.2 mL的玉米黃素儲備液，分別振蕩溶解。以癸酸為空白，在分光光度計上采集300～550 nm范圍內的各溶液電子吸收光譜。測量各光譜的λmax以及在λmax處的吸光度，并計算VⅢ/VⅡ值作為光譜特征的表征[11]。

1.3.3.2 番茄紅素電子吸收光譜的采集

取裝有5 mL癸酸-四氫呋喃、癸酸-丙酮和癸酸-乙醇反膠束溶液的試管各1支，分別加入0.2 mL的番茄紅素儲備液，振蕩溶解。以各溶劑為空白，在分光光度計上獲取波長300～550 nm范圍內各溶液的電子吸收光譜。測量各光譜的λmax以及在λmax處的吸光度，并計算VⅢ/VⅡ值作為光譜特征的表征。

1.3.3.3 β-胡蘿卜素電子吸收光譜的采集

同1.3.3.2節。用β-胡蘿卜素儲備液替換番茄紅素儲備液。

1.3.3.4 玉米黃素電子吸收光譜的采集

同1.3.3.2節。用玉米黃素儲備液替換番茄紅素儲備液。

1.3.3.5 各類胡蘿卜素吸光系數的推導

取裝有5 mL石油醚的試管2支、裝有5 mL丙酮的試管1支，分別加入0.2 mL的番茄紅素、β-胡蘿卜素和玉米黃素的儲備液，振蕩溶解。以各溶劑為空白，在分光光度計上獲取300～550 nm范圍內的各溶液電子吸收光譜。測量各光譜的λmax以及在λmax波長處的吸光度。

表1 類胡蘿卜素在有機試劑中的吸光系數[11]Table 1 Absorption coefficients of the selected carotenoids in organic solvents[11

表1為3種類胡蘿卜素已發表文獻[11]的有機試劑吸光系數。在本項研究中，會首先測定各類胡蘿卜素在有機溶劑中的吸光系數，與表1進行比較，從而檢驗實驗操作與儀器狀態的穩定性。之后，根據測得的各類胡蘿卜素在癸酸反膠束溶液中的吸光度，按公式（1）從3種類胡蘿卜素在有機溶劑中的吸光系數推算各自在癸酸反膠束溶液中的吸光系數。

2 結果與分析

2.1 類胡蘿卜素分子在癸酸中的電子吸收光譜特征

在室溫條件下，癸酸通常以固體狀態存在；當溫度升至35℃后，其變為液體狀態。為了能使癸酸具有流動性，實驗操作與檢測溫度均維持在35℃。

圖3 番茄紅素、β-胡蘿卜素和玉米黃素在癸酸（3355℃）中的電子吸收光譜Fig.3 Electronic absorption spectra of lycopene, β-carotene and zeaxanthin in decanoic acid (35℃)

由圖3可知，其各自的電子吸收光譜峰型與其在有機試劑中的峰型基本一致。癸酸所表現出來的兩親分子特性使得類胡蘿卜素分子的分散不受其分子結構中強電負性羧酸基的影響。癸酸分子結構中的弱極性烷烴鏈使得癸酸在被組裝成反膠束聚合體之前就可以像傳統有機試劑一樣作為類胡蘿卜素溶劑。

對圖3數據進行整理，通過與表1進行比較，得到表2。

表2 癸酸對類胡蘿卜素光譜特征的影響Table 2 Influence of decanoic acid on carotenoid spectral characteristics

由表2可知，番茄紅素、玉米黃素和β-胡蘿卜素在癸酸中的λmax較其在石油醚，均向長波長方向移動了8～9 nm。在電子吸收光譜中，這種λmax向長波長方向的移動意味著溶質的激發態能級大幅降低，即表明：與傳統有機溶劑（如石油醚）相比，溶解在癸酸中的3種類胡蘿卜素在吸收可見光后均處于較低的激發態能級。與此同時，按式（1）所推算出的三者在癸酸中的吸光系數表明：與石油醚相比，番茄紅素和β-胡蘿卜素兩種類胡蘿卜素在癸酸中的吸光系數均有下降，玉米黃素基本持平。已知類胡蘿卜素的吸光系數與其溶劑極性之間存在一定規律，即開環類胡蘿卜素化合物的吸光系數隨溶劑的極性上升而下降[11]?？紤]到癸酸極性大于石油醚，可見番茄紅素和β-胡蘿卜素在癸酸中吸光系數下降的現象都符合上述規律。

2.2 類胡蘿卜素分子在癸酸反膠束溶液中的電子吸收光譜特征

圖4 番茄紅素在癸酸超分子溶液中的電子吸收光譜Fig.4 Electronic absorption spectra of lycopene in decanoic acid-based supramolecular solvents

表3 組裝助劑極性對番茄紅素在癸酸反膠束溶液中光譜特征的影響Table 3 Influence of the polarity of the added solvents on lycopene spectral characteristics in decanoic acid reverse micelle solvents

番茄紅素在癸酸反膠束溶液中的電子吸收光譜如圖4所示，其光譜特征見表3。與癸酸相比，癸酸反膠束溶液中的λmax向短波長方向均發生了2～3 nm移動；處于癸酸反膠束溶液中的番茄紅素其峰形和精細結構發生明顯改變，其VⅢ/VⅡ值均出現顯著下降；其吸光系數均出現升高。λmax向短波長方向的移動表明番茄紅素分子在癸酸反膠束溶液中吸收可見光后其激發態的能級略有升高，躍遷能略有增加；VⅢ/VⅡ值的變化與組裝助劑極性E°呈一定規律，即VⅢ/VⅡ值隨組裝助劑極性上升而下降。而吸光系數的變化既不符合開環類胡蘿卜素化合物的吸光系數隨溶劑的極性上升而下降的規律，而又不是完全符合隨溶劑的極性上升而上升的規律。這說明溶液極性并非是影響吸光系數的唯一因素。不同組裝助劑在組裝癸酸反膠束溶液可能會出現不同的烷烴鏈空間排列結構，吸光系數的改變可能與這種空間排列也有聯系。

表4 組裝助劑極性對-胡蘿卜素在癸酸反膠束溶液中光譜特征的影響Table 4 Influence of the polarity of the added solvents on -carotene spectral characteristics in decanoic acid reverse micelle solvents

由表4可知，與癸酸相比，癸酸反膠束溶液中的λmax向短波長方向均發生了0～1 nm移動；除了四氫呋喃-癸酸反膠束溶液體系VⅢ/VⅡ值出現明顯升高之外，丙酮和乙醇-癸酸反膠束溶液中的β-胡蘿卜其峰形和精細結構發生改變不明顯，其VⅢ/VⅡ值基本一致；其吸光系數均出現下降。λmax向短波長方向0～1 nm的移動幅度表明β-胡蘿卜素分子在癸酸反膠束溶液中吸收可見光后其激發態的能級并未發生明顯變化，躍遷能也沒有出現顯著改變；組裝助劑極性E°改變，VⅢ/VⅡ值并不一定會隨之變化。而其吸光系數的變化與番茄紅素更是不同，單獨討論不同組裝助劑的癸酸反膠束溶液，其吸光系數對癸酸下降的絕對值是隨溶劑的極性上升而上升的，即溶劑的極性越大，吸光系數的下降就越顯著。導致β-胡蘿卜素在癸酸反膠束溶液出現這種現象可能與其分子的環狀端基結構有關。與番茄紅素相比，β-胡蘿卜素雖同屬碳氫化合物，但分子結構中的六元環顯然發揮了影響。

表5 組裝助劑極性對玉米黃素在癸酸反膠束溶液中光譜特征的影響Table 5 Influence of the polarity of the added solvents on zeaxanthin spectral characteristics in decanoic acid reverse micelle solvents

由表5可知，與癸酸相比，玉米黃素在3種癸酸反膠束溶液中的λmax變化不明顯，VⅢ/VⅡ值亦無顯著變化，其吸光系數均出現下降。不同組裝助劑的癸酸反膠束溶液，其吸光系數對癸酸下降的絕對值是隨溶劑的極性上升而上升的，這與β-胡蘿卜素趨勢一致。在實驗中，最為顯著的現象是：玉米黃素在癸酸和3種反膠束溶液中的吸光系數與β-胡蘿卜素的極其接近。與β-胡蘿卜素相比，玉米黃素雖同屬具環類胡蘿卜素，但分子中的羥基對分子的吸收系數影響不大，但在VⅢ/VⅡ值的變化上二者具有顯著差別。

3 討 論

3.1 類胡蘿卜素分子結構對光譜的影響

分子中的六元環端基可以吸收可觀的能量，決定分子躍遷能的大小，使分子受溶劑環境變化的影響減小，如：最大吸收波長的移動程度減小、VⅢ/VⅡ值保持穩定、吸光系數變化較小、對溶劑極性的變化不敏感等。 羥基對分子的電子吸收光譜影響有限[15]。

3.2 癸酸環境對光譜的影響

液相癸酸本身對類胡蘿卜素化合物是一個良好的溶劑。在組裝成反膠束結構后，其活性基團為外側的烴基鏈，極性有所下降。因此對類胡蘿卜素類化合物的溶解性加強。因此，癸酸反膠束溶液起到了穩定溶質分子激發態能級的作用。當組裝助劑的極性發生變化時，組裝成的聚集體極性也發生了變化。組裝助劑的極性越強，癸酸反膠束外側的烴基鏈暴露得越多，反膠束結構越穩定，作為溶媒，極性越弱，對類胡蘿卜素的溶解越有益。

3.3 癸酸反膠束溶液在類胡蘿卜素檢測中的應用前景

在類胡蘿卜素的檢測中，已經開始使用癸酸反膠束溶液作為樣品萃取溶媒。本項研究的結果表明：癸酸反膠束溶液可能導致溶液中類胡蘿卜素的電子吸收光譜發生一定程度的變化。這些變化有一定規律可循。應用外標或內標法，可以在癸酸超分子溶液中根據其電子吸收光譜直接對類胡蘿卜素進行定量測定。在今后的研究中，癸酸反膠束溶液環境對類胡蘿卜素分子吸光系數的影響應該是重要的研究內容。這種努力將導致在定量測定中可直接應用Lamber-Beer定律計算許多類胡蘿卜素在樣品中的含量。

[1] RUIZ F, RUBIO S, PéREZ-BENDITO D. Water-induced coacervation of alkyl carboxylic acid reverse micelles: phenomenon description and potential for the extraction of organic compounds[J]. Anal Chem, 2007, 79(19): 7473-7484.

[2] LEHN J, BALL P, HALL N. The new chemistry[M]. Cambridge: Cambridge University Press, 2000: 300-351.

[3] PELESKO J. Self assembly: the science of things that put themselves together[M]. New York: Chapman & Hall/CRC, 2007: 67-80.

[4] LEHN J. Toward complex matter: supramolecular chemistry and selforganization[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99(8): 4763-4768.

[5] STEED J, TURNER D, WALLACE K. Core concepts in supramolecular chemistry and nanochemistry[M]. Chichester: John Wiley & Sons Inc, 2007: 1-27.

[6] EVANS D, WENNERSTR?M. The Colloidal domain.where physics, chemistry, biology, and technology meet[M]. New York: Wiley-VCH, 1999: 197-198.

[7] HAO Lisheng, NAN Yanqing. Salt-induced aqueous two-phase systems of oppositely charged surfactants with excess anionic surfactant[J]. Colloids Surf A, 2008, 325(3): 186-193.

[8] 中華人民共和國衛生部. GB 28316－2012 食品安全國家標準 食品添加劑 番茄紅[S]. 北京: 中國標準出版社, 2012.

[9] 李京, 惠伯棣. 番茄紅素在體內代謝中的幾何異構體組成變化[J].食品科學, 2008, 29(9): 591-594.

[10] 中華人民共和國衛生部. GB 5413.35—2010食品安全國家標準 嬰幼兒食品和乳品中β-胡蘿卜素的測定[S]. 北京: 中國標準出版社, 2010.

[11] 惠伯棣. 類胡蘿卜素化學及生物化學[M]. 北京: 中國輕工業出版社, 2005: 175-179.

[12] 惠伯棣. 超臨界CO2中全反式β,β-和Φ，Φ-胡蘿卜素的電子吸收光譜位移研究[J]. 食品科學, 2008, 29(10): 125-128.

[13] 何強強, 惠伯棣, 宮平. 超臨界CO2密度對全反式番茄紅素吸光系數的影響[J]. 食品科學, 2012, 33(15): 52-56.

[14] 蔡靳, 惠伯棣, 蔣繼志. 玉米黃素及在食品中的應用研究進展[J]. 中國食品添加劑, 2012(2): 163-170.

[15] BRITTON G, LIAAEN-JENSEN S, PFANDER H. Carotenoids: spectroscopy[M]. Basel: Birkh?user, 1995.

Variations in the Electronic Absorption Spectral Characteristics of Carotenoids in Decanoic Acid Reverse Micelle Solvents

HUANG Jin1, HUI Bo-di1,*, CAI Jin2, GONG Ping1, GUAN Xin1
(1. College of Applied Arts and Science, Beijing Union University, Beijing 100191, China; 2. College of Life Science, Hebei University, Baoding 071002, China)

This study aimed to analyze the electronic absorption spectral acquisition and characteristics of three carotenoids in dacanoic acid reverse micelle solvents. In the present study, tetrahydrofuran, acetone and ethanol were selected to separately construct decanoic acid reverse micelles. After lycopene (acyclic hydrocarbon), β-carotene (cyclic hydrocarbon) and zeaxanthin (cyclic hydroxyl compound) were dissolved in each solvent, the electronic absorption spectra of the solutions were acquired over the wavelength range of 300－550 nm. The spectral characteristics were consequently assessed. Data from these investigations suggested that a slight shift in the maximum absorption wavelength (λmax) of all three carotenoids were observed in decanoic acid reverse micelle solvents, in comparison with those in decanoic acid. A bathochromic shift was seen with cyclic carotenoids and a hypsochromic shift was seen with acyclic carotene. Additionally, an increased polarity of the added organic solvents could result in a reduced absorption coefficient (A1%1cm).

decanoic acid; reverse micelle solvent; electronic absorption spectrum; lycopene; β-carotene; zeaxanthin

TS202.3

A

1002-6630(2014)01-0115-05

10.7506/spkx1002-6630-201401022

2012-10-29

黃金（1991—），男，本科，研究方向為食品質量與安全。E-mail：huangjin0808@163.com

*通信作者：惠伯棣（1959—），男，教授，博士，研究方向為類胡蘿卜素化學及生物化學。E-mail：bodi_hui@ygi.edu.cn