蓽茇寧對小鼠酒精性脂肪肝的預防作用

昭日格圖，白朝魯門，博格日勒圖，娜日蘇，領 小

（內蒙古大學化學與化工學院，內蒙古 呼和浩特 010021）

蓽茇寧對小鼠酒精性脂肪肝的預防作用

昭日格圖，白朝魯門，博格日勒圖，娜日蘇，領 小

（內蒙古大學化學與化工學院，內蒙古 呼和浩特 010021）

目的：探討蓽茇成分蓽茇寧（piperlonguminine，GBN）對小鼠酒精性脂肪肝肝損傷的預防作用。方法：將成年雄性昆明小鼠隨機分為空白對照組、酒精性脂肪肝模型組以及GBN（低、高）劑量組?？瞻讓φ战M以基礎飼料喂養，其余各組以高脂飼料喂養并每天用白酒按0.8 mL/30 g灌胃；GBN低劑量（10 mg/（kg?d））和高劑量組（40 mg/（kg?d））組分別按設計的藥物和劑量給予小鼠灌胃，給藥體積為0.8 mL/30 g體質量，空白對照組、模型組給予相同體積的水灌胃，連續給藥6 周。于實驗第6周末，測定各組小鼠體質量、肝臟指數，檢測血清丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）活力、總膽固醇（total cholesterol，TC）和甘油三酯（triglyceride，TG）含量，并做肝臟病理學檢查。結果：GBN低、高劑量組肝臟指數分別為（4.42±0.50）%、（4.53±0.44）%，與模型組比較均顯著降低；血清ALT與AST活力極顯著降低（P＜0.01）；血清TC與TG含量極顯著降低（P＜0.01）；同時病理組織學顯示GBN能明顯改善酒精性脂肪肝小鼠的肝細胞脂肪變性。結論：GBN夠有效預防酒精性脂肪肝的發生或發展。

蓽茇寧；酒精性脂肪肝；血脂；丙氨酸氨基轉移酶；天冬氨酸氨基轉移酶；肝臟組織切片

臨床上依據飲酒與否，可將脂肪肝分為酒精性脂肪肝?。╝lcoholic fatty liver disease，AFLD）和非酒精性脂肪肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）。人們生活方式和飲食結構的變化，導致脂肪肝的發病率急劇上升，我國部分地區人脂肪肝病的發病率已高達20%，而這其中纖維化的比例高達25%，約1.5%～8.0%的患者可發展為肝硬化，因此脂肪肝病已成為較嚴重的醫學問題[1]。單純性酒精引起脂肪肝的發病機制至今尚未明確，脂肪代謝異常、脂質過氧化損傷以及氧化應激等因素可能起一定的作用[2-3]。目前國內市場上在治療酒精性脂肪肝方面還沒有療效十分顯著的創新藥，不過最近報道3-羥基-3甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑辛伐他丁可顯著改善酒精性脂肪肝患者的肝功能[4]。

蓽茇為一種藥食兩用植物，喜高溫潮濕氣候，主產于中國云南省。博日吉汗·格日勒圖等[5-9]曾報道蓽茇成分蓽茇寧（piperlonguminine，GBN）具有降血脂作用。本實驗探討和研究了GBN對酒精性脂肪肝的預防作用。用小鼠酒精性脂肪肝動物模型進行GBN的體內保肝實驗，探討GBN是否具有保肝生物活性，為GBN防治酒精性脂肪肝提供一定的實驗基礎和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

成年雄性昆明小鼠，體質量（20±2）g，許可證號：SCXK（京）2006-2009，級別SPF/AF，由北京維通利華實驗動物中心提供。

蓽茇寧（GBN）由內蒙古大學蒙藥化學研究所制備，純度＞98%，上述藥物臨用前用質量分數0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液制成相應濃度的混懸液。

草原白酒（酒精度52%） 內蒙古太仆寺旗草原釀酒有限責任公司；丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）測定試劑盒 北京中生北控生物科技股份有限公司。

高脂飼料配方（質量分數）：膽固醇3%、豬油10%、膽酸鈉0.5%、基礎飼料86.5%（配方：面粉20%、米粉10%、玉米20%、麩皮25%、豆料20%、骨粉2%、魚粉2%、食鹽0.9%、維生素0.1%）。

1.2 儀器與設備

5) 多系統聯動。系統生成的報警信息，操作人員可以派單至巡檢系統，同時將巡檢情況回傳至診斷系統，真正實現閉環管理。

電子天平 梅特勒-托利多公司；奔騰加強型全自動生化分析儀 意大利奔騰公司；TDL-5-A離心機上海創萌生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組及給藥方法

成年雄性昆明小鼠40 只，體質量（20±2）g，實驗前在實驗環境下（室溫20～24 ℃，相對濕度50%～60%，自由飲水）飼喂3 d后，按體質量隨機分成4 組，每組10 只，分別為空白對照組、酒精性脂肪肝模型組、GBN低劑量組和GBN高劑量組?？瞻讓φ战M基礎飼料喂養，其余各組以高脂飼料喂養，并每天用白酒（將酒精度52%白酒稀釋為30%）灌胃（0.8 mL/30 g）；GBN低劑量組（10 mg/kg）和GBN高劑量組（40 mg/kg）分別按設計的藥物和劑量給予小鼠灌胃，給藥體積為0.8 mL/30 g體質量，空白對照組、模型組給予相同體積的水灌胃，連續給藥6 周。

1.3.2 標本的采集和處理

第6周周末最后一次灌胃后，禁食12 h，稱體質量。斷頭取血，解剖取肝臟稱質量。計算其肝臟指數。采集的血液放置于4 ℃冰箱冷藏過夜，低溫離心機3 500 r/min離心10 min，取上層血清于－70 ℃冷凍保存備用。肝臟在稱質量后立即放入體積分數4%甲醛溶液固定24 h保存，數周后用石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）法染色，光鏡下觀察組織病理學變化。

1.3.3 生化指標的測定

血清ALT、AST、TC、TG水平，嚴格按照中華人民共和國衛生部醫政司全國臨床檢驗操作規程操作。

1.4 統計學方法

數據均采用SPSS 18.0軟件進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 GBN對脂肪肝小鼠體質量、肝臟質量以及肝臟指數的影響

表1 GBN對酒精性脂肪肝小鼠體質量及肝臟指數的影響（x±s，n=10）Table 1 Effects of GBN on the body weight and liver index (x ±s,n=10)

由表1可知，實驗始末各組小鼠體質量差異無統計學意義（P＞0.05）。然而與空白對照組比較，模型組長期飲酒（30%，0.8 mL/30 g）會導致肝臟質量和肝臟指數極顯著增長（P＜0.01），因為酒精性脂肪肝的特征之一是肝腫大[10-12]，與模型組相比較，GBN高、低劑量組能極顯著降低肝臟質量（P＜0.01）和顯著降低肝臟指數（P＜0.05），說明GBN高、低劑量組均能改善肝腫大。

2.2 GBN對酒精性脂肪肝小鼠肝臟細胞脂肪變性的影響

小鼠肝臟HE染色后顯微鏡下病理切片照片顯示，空白對照組（圖1A）小鼠的肝小葉結構清晰，肝內無脂肪變性、沒有炎癥和壞死的細胞，肝細胞索排列整齊，肉眼觀察肝臟呈鮮紅色，表明肝內沒有明顯的脂肪堆積。酒精性脂肪肝模型組（圖1B）肝小葉結構不清晰，肝細胞普遍明顯腫大，具有嚴重脂肪變性現象，核增大，肝細胞索排列無規律，肉眼觀察肝臟顏色呈淡紅色，表明肝內明顯積聚了脂肪。GBN低劑量組（圖1C）肝細胞普遍中度脂肪變性。GBN高劑量組（圖1D）肝細胞普遍輕度脂肪變性。結果表明，與空白對照組比較，模型組的肝細胞脂肪變性明顯；與模型組相比，各給藥組的肝細胞脂肪變性明顯減輕，說明GBN對酒精性脂肪肝具有一定的防治作用。

圖1 各組小鼠肝臟HE染色后顯微鏡下病理切片照片（HE，×400）Fig.1 Pathology slice images of mouse liver in each group under the microscope after HE staining (HE, × 400)

2.3 GBN對酒精性脂肪肝小鼠血清ALT、AST活力的影響

表2 GBN對酒精性脂肪肝小鼠血清ALT、AST活力的影響（x±s，n=10）Table 2 Effects of GBN on serum levels of ALT and AST (x±s，n=10)

由 表2可知，空白對照組血清A L T活力為（42.39±11.94）U/L；AST活力為（186±57）U/L，模型組血清ALT活力為（413.78±145.80）U/L；AST活力為（2 977±770）U/L，表明酒精灌胃法已對小鼠肝臟造成損傷，肝細胞可能發生炎癥、壞死。酒精性脂肪肝模型制備成功。

本動物模型實驗中，GBN樣品可以顯著降低轉氨酶（ALT、AST）。表2中顯示GBN高、低劑量組血清ALT活力為（76.17±67.78）、（117.62±96.12）U/L以及血清AST活力為（280±156）、（208±94）U/L。與模型組相比較，GBN（低、高）劑量組均能極顯著降低血清ALT、AST活力（P＜0.01），表明GBN對酒精造成的肝損傷具有一定的預防作用。

2.4 GBN對酒精性脂肪肝小鼠血清TC、TG水平的影響

由表3可知，模型組 TG、TC含量比較空白對照組明顯升高，有極顯著性差異（P＜0.01）；給予GBN后，實驗小鼠血清中的TC和TG含量比模型組明顯降低，有極顯著性差異（P＜0.01）。由此可知GBN具有抑制TC生成、促進TG氧化分解的作用，從而影響脂質分布、運轉與清除。

表3 GBN對酒精性脂肪肝小鼠血清TC、TG含量的影響（x±s， n=10）Table 3 Effects of GBN on serum levels of TC and TG (x±s , n=10

3 討 論

3.1 蓽茇寧對酒精性脂肪肝模型小鼠血脂的影響

甘油三酯是體內能量的重要來源，也是人體內含量最多的脂類，其合成的主要場所在肝臟。當肝臟功能受損時，可能會阻礙肝臟合成甘油三酯、磷脂或載脂蛋白，致使甘油三酯無法轉運出肝臟。如此，機體脂類代謝紊亂、過氧化損傷、肝細胞甘油三酯蓄積，致使肝細胞脂肪變性及脂肪肝形成[13-14]。本課題組首次發現蓽茇寧具有降血脂作用，并獲得發明專利一項[15]。本實驗發現模型組TG、TC含量比空白對照組明顯升高，差異極顯著（P＜0.01）；給予GBN后，實驗小鼠血清中的TC和TG含量比高脂模型對照組明顯降低，差異極顯著（P＜0.01）。由此可知GBN具有抑制TC生成、促進TG氧化分解的作用，從而影響脂質分布、運轉與清除。

3.2 蓽茇寧對酒精性脂肪肝模型小鼠血清ALT、AST活力的影響

乙醇代謝過程中產生的活性氧可損害細胞膜以及線粒體膜，細胞膜通透性增強，使肝細胞中的轉氨酶滲透至血液中，造成血液中ALT和AST活力的升高[16-17]。在生物體內，AST和ALT是反映肝細胞損害的常用酶學檢查指標，是肝細胞損害的敏感標志[18]。本實驗中，GBN樣品各組可以顯著降低血清中轉氨酶（ALT、AST）。GBN高、低劑量組與模型組相比較血清ALT、AST指標，GBN（低、高）劑量組均能極顯著降低血清ALT、AST活力（P＜0.01），表明GBN對酒精造成的肝損傷具有一定的預防作用。

3.3 蓽茇寧對酒精性脂肪肝模型小鼠肝臟組織

肝臟在脂類的吸收、運輸、合成、貯存、分解等過程中均起到重要的作用。長期攝入乙醇及高脂食物會導致肝臟脂肪代謝紊亂[19-21]。本實驗中空白對照組小鼠的肝小葉結構清晰，肝內無脂肪變性、沒有炎癥和壞死的細胞，肝細胞索排列整齊，肉眼觀察肝臟呈鮮紅色，表明肝內沒有明顯的脂肪堆積。酒精性脂肪肝模型組小鼠肝小葉結構欠清晰，肝細胞普遍明顯腫大，具有嚴重脂肪變性，核增大，肝細胞索排列無規律，肉眼觀察肝臟顏色呈淡紅色，表明肝內明顯積聚了脂肪。GBN低劑量組肝細胞普遍中度脂肪變性。GBN高劑量組肝細胞普遍輕度脂肪變性。結果表明，與空白對照組比較，模型組的肝細胞脂肪變性明顯；與模型組相比，各給藥組的肝細胞脂肪變性明顯減輕，說明GBN對酒精性脂肪肝具有一定的防治作用。

綜上所述，本實驗條件下，GBN可通過降低酒精性脂肪肝小鼠血脂水平，調節肝功能指標，從而有效的預防了酒精性脂肪肝的發生和發展。該病是一種可預防的疾病，具有可逆性，但由于人體長期飲酒對酒精易產生依賴性，所以患者能否做到酒精戒斷是影響該病治療效果的重要條件，只有在戒酒的基礎上配合以藥物治療才能取得好的療效，這就需要全社會對飲酒的危害性給予關注并進行廣泛深入的宣傳。

[1] 張龑之, 張瑜, 李琳琳, 等. 葫蘆巴總皂苷對大鼠酒精性脂肪肝的治療作用[J]. 中華肝臟病雜志, 2006, 14(11): 854-856.

[2] 班超, 戴敏, 顏貴明. 丹皮藥用組合物對酒精性脂肪肝大鼠的作用[J]. 安徽中醫學院學報, 2009, 28(5): 49-51.

[3] DING Renbo, TIAN Ke, HUANG Lili, et al. Herbal medicines for the prevention of alcoholic liver disease: a review[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2012, 144(3): 457-465.

[4] 陳泓強, 張健, 姚洪森, 等. 酒精性脂肪肝的診斷及治療發展[J]. 河北醫藥, 2007, 29(6): 616-617.

[5] JIN Zhuang, BORJIHAN Gereltu, ZHAO Ruiguo, et al. Antihyperlipidemic compounds from the fruit of Piper longum L.[J]. Phytothepapy Research, 2009, 23(8): 1194-1196.

[6] SARNAIZULA E, BORJIHAN G, BAIGUDE H, et al. LC analysis and pharmacokinetic study of synthetic piperlonguminine in rat plasma after oral administration[J]. Biomedical Chromatography, 2013, 27(7): 821-824.

[7] SARNAIZULA E, BORJIHAN G, ZHAORIGETU S. The preparation and antihyperlipidaemic assay of piperlonguminine in vivo[J]. Phytochemistry Letters, 2013, 6(1): 101-105.

[8] 麻春杰, 哈斯阿古拉, 張立全, 等. 蓽茇寧對高脂血癥大鼠血脂代謝及其相關基因表達的影響[J]. 中草藥, 2008, 39(7): 1039-1043.

[9] 趙睿國.蓽茇降血脂成分的提取、分離、結構測定和藥效研究[D].呼和浩特: 內蒙古大學, 2004.

[10] XIANG Jinle, ZHU Wenxue, LI Zhixi, et al. Effect of juice and fermented vinegar from Hovenia dulcis peduncles on chronically alcohol-induced liver damage in mice[J]. Food & Function, 2012, 3(6): 628-634.

[11] KIM S J, LEE S M. Effect of baicalin on toll-like receptor 4-mediated ischemia/reperfusion in ammatory responses in alcoholic fatty liver condition[J]. Toxicology and Applied Pharmacology, 2012, 258(1): 43-50.

[12] DARWISH H A, ABD RABOH N R, MAHDY A. Camel’s milk alleviates alcohol-induced liver injury in rats[J]. Food and Chemical Toxicology, 2012, 50(5): 1377-1383.

[13] 梁衛, 吳承玉, 梁濤. 清肝利濕解酒湯對酒精性脂肪肝大鼠肝損傷保護作用研究[J]. 中國實驗方劑學雜志, 2013, 19(4): 163-167.

[14] 白明, 汪保英, 苗明三. 保肝降脂膠囊對酒精性脂肪肝大鼠的實驗研究[J]. 中醫學報, 2013, 28(4): 537-538.

[15] 博日吉汗格日勒圖, 那生桑, 金樁, 等. 胡椒酰胺類化合物在制備降血脂的藥物和保健品中應用: 中國, ZL200410096611.7[P]. 2006-02-08.

[16] 魏兆偉. AST/ALT在肝病中的診斷意義[J]. 中華醫學實踐雜志, 2006, 5(8): 67-69.

[17] 張健, 姚洪森, 賀南方, 等. 脂肪肝的診斷治療進展[J]. 河北醫藥, 2003, 25(2): 121.

[18] 冼永超, 楊景毅, 徐茹, 等. 血清谷氨酰轉肽酶含量測定在慢性乙型肝炎中的臨床意義[J]. 中華實驗和臨床病毒學雜志, 2007, 21(4): 383-385.

[19] 張建華, 楊文東, 劉民. 長期大量飲酒者肝功能和血脂檢測指標變化的臨床分析[J]. 實用診斷與治療雜志, 2006, 20(4): 258-259; 262.

[20] SAMUEL V T, LIU Zhenxiang, QU Xianqin, et al. Mechanism of hepatic insulin resistance in non-alcoholic fatty liver disease[J]. Biological Chemistry, 2004, 279(31): 32345-32353.

[21] 井源, 韓婷, 吳靜, 等. 酒精性脂肪肝病理學研究進展[J]. 實用肝臟病雜志, 2008, 11(1): 67-69.

Preventive Effects of Piperlonguminine on Alcoholic Fatty Liver Disease in Mice

ZHAO Ri-ge-tu, BAI Chao-lu-men, BO Ge-ri-le-tu, NA Ri-su, LING Xiao
(College of Chemistry and Chemical Engineering, Inner Mongolia University, Hohhot 010021, China)

This study aimed to investigate the preventive and therapeutic effects of piperlonguminine (GBN) on alcoholic fatty liver disease (AFLD) in mice. Adult male Kunming mice were randomly divided into four groups: normal control, model, GBN low dose and high dose groups. The mice in normal control group were fed with a normal diet, and those in the other groups were fed with high-fat diet, and, at the same time, administered with alcohol daily at a level of 0.8 mL/30 g bw. The mice in GBN low and high dose groups were intragastrically administered with 0.8 mL/30 g bw of GBN at doses of 10 and 40 mg/(kg·d), respectively, and the normal control and model groups were given equal volume of distilled water, continuously for 6 weeks. After 12 h of fasting following the last administration, all the mice were sacrificed for the measurement of liver index, aspartate transaminase (AST), alanine transaminase (ALT), total cholesterol (TC) and triglyceride (TG) levels in serum and the pathological histological observation of liver tissue. Compared with the model group, the low and high dose groups significantly decreased liver index to (4.42 ± 0.50)% and (4.53 ± 0.44)%, respectively. Also, the levels of AST, ALT, TC and TG in serum were significantly decreased (P ＜ 0.01). And pathological histology showed that GBN obviously improved hepatocyte fatty degeneration of alcoholic fatty liver in mice. In conclusion, GBN can effectively prevent the occurrence and development of alcoholic fatty liver.

piperlonguminine; alcoholic fatty liver disease; blood fat; alanine transaminase; aspartate transaminase; liver tissue slices

R151.3

A

1002-6630（2014）13-0232-04

10.7506/spkx1002-6630-201413045

2014-04-02

國家“重大新藥創制”科技重大專項（2009ZX09103-103）

昭日格圖（1969—），男，助理研究員，博士，主要從事保健品、食品研究。E-mail：zhrgt@163.com