宰后高溫誘導制備類PSE兔肉

王曉香，劉 爽，尚永彪,2,3,*，彭增起

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400716；2.農業部農產品貯藏保鮮質量安全評估實驗室（重慶），重慶 400716；3.重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶 400716；4.南京農業大學 農業部農畜產品加工與質量控制重點開放實驗室，江蘇 南京 210095）

蒼白、松軟、表面汁液滲出（pale soft exudative，PSE）肉不僅因感官品質不良而難以正常銷售，而且因保水性和熱誘導凝膠形成能力差也不利于加工。1953年，Ludvigsen等[1]首次定義了PSE豬肉并闡述了其形成機理，近十幾年的研究發現，PSE肉在各類肉中（包括魚肉）均廣泛出現，尤其在豬、火雞和雞上發生率較高[2]。學者經過半世紀的研究發現PSE肉產生的主要原因有遺傳缺陷、宰前的應激反應和宰后持續高溫存放[3-5]。

為了便于開展PSE肉的研究，學者們目前均采用高溫誘導的方法制備“類PSE肉（PSE-like meat）”，由剛屠宰的肉在高溫條件下（35～40℃）處理一定的時間得到。Lesiów等[6]研究表明將豬背最長肌在35℃條件下保溫7 h即可制得PSE肉。Zhu等[7]研究了宰后早期高溫誘導（0、20、40℃）對肉雞PSE肉發生率的影響，結果發現40℃水浴保溫4 h后，肌肉的亮度（L*）和滴水損失（drop loss，DL）較高，蛋白質的溶解度較低，出現了PSE肉的特征。Molette等[8]研究表明火雞胸肉在40℃條件下處理6 h，表現出了PSE肉的特征，即肌肉柔軟、保水能力和加工性能都較差。PSE肉可以用主觀和客觀方法來鑒別。主觀方法依賴于檢查者的經驗，而客觀的方法目前主要基于pH值、L*和DL的測定。許多研究者以DL和L*值作為分類PSE豬肉的依據[9-10]，如DL＞6%、L*＞50的肉為PSE；反之為RFN（紅色、堅實、無汁液滲出）；也有人把DL、L*和pH值結合分類PSE肉，如DL＞5%、L*＞50（或L*＞55）、pH1h＜5.6的肉為PSE。禽肉“類PSE肉”的分類指標主要是肉色L*值，如Zhang等[11]認為肉雞“類PSE肉”的鑒別標準為：L*＞56。

長期以來，國內外學者關于豬、禽類PSE肉的研究已經很多，但對兔PSE肉的研究卻鮮見報道。我國是兔肉第一生產大國，據調查，國內兔肉宰后高溫環境下存放及運輸的現象還很普遍、PSE肉的發生率較高。目前，國內外還沒有類PSE兔肉制備方法的報道，本研究以pH值、色澤 、彈性、蛋白質溶解度和流變學性質等為指標，研究熱誘導制備類PSE兔肉的方法，為兔PSE肉的研究提供方便。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取飼養環境和飼料配方均相同，3月齡、平均體質量2.5 kg的雄性伊拉兔20 只，由西南大學種兔養殖場提供。

乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉 成都市科龍化工試劑廠；疊氮化鈉 青島海泰生物技術有限公司；標準牛血清白蛋白（albumin from bovine serum，BSA） 上海雪滿生物科技發展有限公司；氯化鈉 重慶博藝化學試劑有限公司；硫酸銅重慶吉元化學有限公司；鹽酸 重慶川東化工（集團）有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

FA2004B型電子天平 上海精天電子儀器廠；DF8517型超低溫冰箱 韓國Ilshin公司；MAP-500型袋式氣調保鮮包裝機 上海炬鋼機械制造有限公司；pHS-4C+酸度計 成都世紀方舟科技有限公司；Hunterlab D25色差儀 美國Hunterlab 公司；722可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；1-15PK冷凍離心機 德國Sigma公司；HH-6型數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；HJ-3型恒溫磁力加熱攪拌器 江蘇城西曉陽電子儀器廠；HR-1流變儀 美國TA公司；TA.XT2i質構儀英國Stable Micro Systems公司。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

伊拉兔宰前禁食12 h，宰后立即在－18℃條件下冷卻到中心溫度低于4℃，用已消過毒的刀具和砧板在無菌操作臺上去掉筋腱并分割（分割過程在宰后30 min內完成），沿著垂直肌纖維方向將分割后的背最長肌和腿肌切成20 g左右的肉塊，分別在10 mmol/L疊氮化鈉溶液中浸泡5 s，裝入聚乙烯袋中進行真空包裝，包裝后的肉樣隨機分成4 組（背肌和腿肌各兩組），一組背肌和一組腿肌作為對照樣，放在4℃冰箱中貯藏，用于測定起始點的各項指標（感官色澤、pH值等）[12-14]。其余兩組肉用于PSE肉的制備，并放在37℃恒溫水浴鍋中，恒溫0、1、2、3、4、5 h后取出，放在4℃冰箱中冷卻。冷卻后進行感官指標、pH值、色澤、失水率、彈性、肌原纖維蛋白溶解度、流變學性質的測定。

1.3.2 感官評價

由6人組成感官評定小組，每次從水浴鍋中取出兔背肌和腿肌各3袋，打開包裝袋，分別從肉的色澤、表面汁液滲出、彈性等方面進行綜合評價，感官標準如表1所示[15-16]。

表1 感官評定標準Table1 Grading criteria for PSE meat

1.3.3 pH值的測定

稱取兔肉樣品5 g，切碎放入250 mL燒杯中，加入50 mL、0.1 mol/L KCl溶液，靜置30 min，期間每隔5 min用玻璃棒攪拌1次，然后過濾，取濾液進行測定[16]。pH值參考標準[17]：正常肉pH 6.1～6.5；輕度PSE肉pH 5.5～5.9；中度PSE肉pH 5.0～5.4；重度PSE肉pH＜5.0。

1.3.4 色澤的測定

切取一定量的兔肉樣品，置于色差儀的圓孔上用手輕輕摁住，經過黑白板校正，然后測定、讀取色差儀顯示的數值（L*、a*、b*），其中L*值表示亮度；a*值表示紅色度值；b*值表示黃色度值。

1.3.5 失水率的測定

加壓前后兔肉樣品質量的差異即為肉樣失水質量。用取樣刀從兔肉樣品中切取1 cm厚的均勻肉片，平放在干凈的橡皮板上，用直徑為2.523 cm的圓形取樣器切取中心部肉樣，立即用感量為0.001 g的天平稱質量，記為m1（g）；然后放在鋪有18 層定性濾紙的壓力儀平臺上，肉樣上方再放18 層定性濾紙，加壓至35 kg并維持5 min。濾紙的層數可根據兔肉樣品保水性情況調整，并以水分不滲出、能夠全部吸盡為準[18-20]。撤除壓力后，立即稱肉樣質量，記為m2（g）。按照公式（1）計算汁液損失率。

1.3.6 彈性的測定

參照陳文博[21]的測定方法。試樣在80℃恒溫水浴鍋中加熱到中心溫度70℃，并保持30 min，取出冷卻至室溫（20±2）℃，用濾紙吸干肉樣表面的水分，再用直徑為1 mm的圓形空心取樣器沿肌纖維方向鉆取肉樣，且取樣位置距離樣品邊緣不少于5 mm，兩個取樣的邊緣間距也不少于5 mm。然后采用TA-XTPlus質構儀測定彈性，質構儀的參數設置如下：探頭類型：P5；測前速率：1 mm/s；測中速率：0.5 mm/s；測后速率：1 mm/s；壓縮比：50%；觸發類型：auto；數據攫取速率：200 pps；停留時間：5 s。每個樣品選取3個點，每個點測定3次，取9次的平均值即為測定結果。

1.3.7 肌原纖維蛋白溶解度的測定

1.3.7.1 肌原纖維蛋白質的提取

參照Xiong Youling等[22]的方法并稍加改進：將肉樣的脂肪和結締組織剔除，用絞肉機把兔肉絞成2 mm大小的肉粒，稱取4 g，加入肉樣質量4倍體積的磷酸緩沖液（0.1 mol/L NaCl，50 mmol/L磷酸（K2HPO4/KH2PO4），1 mmol/L NaN3），高速勻漿1 min，并用兩層紗布過濾，在5 000 r/min、4℃冷凍離心機中離心15 min，倒出上清液，重復以上步驟兩次。然后用4倍體積0.1 mol/L NaCl溶液沖洗沉淀，高速勻漿30 s，再在5 000r/min、4℃離心15 min，倒出上清液。將8倍體積0.1 mol/L NaCl溶液與沉淀物混合。調整混合溶液的pH值至6.25，最后在相同條件下離心15 min，倒掉上清液，剩余殘渣就是肌原纖維蛋白。

1.3.7.2 蛋白質溶解度的測定

參考Kingsley等[23]的方法并作適當的修改，在4℃的條件下，取一定量的肌原纖維蛋白質沉淀，加入一定體積的磷酸鹽緩沖液（0.6 mol/L NaCl，50 mmol/L Na2HPO4，pH值調至6.25），5 000 r/min分散均勻，使其充分溶解，分散過程中盡量避免產生氣泡，將其制成蛋白質質量濃度為2.5 mg/mL的溶液，放置1 h，取出后 在5 000 r/min的條件下離心15 min，取上清液，用雙縮脲法[24]測定肌原纖維蛋白質的質量濃度，空白為未加肌原纖維蛋白質的磷酸鹽緩沖溶液。肌原纖維蛋白質溶解度計算見公式（2）。

1.3.8 流變學性質的測定

參考Omana等[25]的方法并做適當修改，取一定量的肌原纖維蛋白沉淀，加入一定體積的磷酸鹽緩沖液（0.02 mol/L K2HPO4/KH2PO4、pH 7.0），5 000 r/min分散均勻，分散過程中盡量避免產生氣泡，將其制成蛋白質質量濃度為15 mg/mL的溶液。暴露在外面的樣品擦干并用液體石蠟密封，以免試樣在加熱過程中水分蒸發。采用40 mm的夾具，頻率1 Hz，應變0.005，樣品以1℃/min的速率從20℃加熱至85℃，在85℃保持3 min，然后以5℃/min的速率從85℃冷卻至5℃，狹縫1 mm。

1.4 統計分析方法

每個實驗重復3次。實驗所得數據用Microsoft Office 2007的Excel軟件計算±s，采用Origin8.6軟件作圖，SPSS Statistics 17.0統計軟件進行差異顯著性分析（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 感官指標的變化

表2 兔背肌肉感官評定結果Table2 Sensory evaluation results of rabbit longissimus dorsi

由表2可知，水浴2 h，兔背肌肉表現出了輕度PSE肉的特征，這與后續測定的色澤指標中亮度的增加、紅色度值的降低、pH值的變化、失水率的升高及彈性的下降相一致；水浴3 h和4 h的背肌肉的顏色近似灰白（圖1a），表現出了中度PSE肉的特征，這與L*值的增大、a*值和彈性的顯著下降相符合（P＜0.05）；5 h的背肌肉表現出了重度PSE肉的特征。

由表3可知，水浴3 h，兔腿肌肉表現出了輕度PSE肉的特征，這與后面測定的pH值的變化、L*值的增加、a*值的顯著降低、失水率的升高相符合（P＜0.05）；4 h腿肉表現出了中度PSE肉的特征，這與L*值的增大、a*值的下降和失水率的增加相一致；5 h腿肌肉的顏色近似灰白（圖1b），肌肉疏松，表現出了重度PSE肉的特征。

表3 兔腿肌肉感官評定結果Table3 Sensory evaluation results of rabbit rear leg muscle

圖1 正常肉和PSE肉外觀色澤的比較Fig.1 Comparison of the color of RFN and PSE rabbit meat

2.2 pH值的變化

圖2 37℃水浴條件下兔背肌和腿肌pH值的變化Fig.2 Changes in pH of rabbit rear leg and longissimus dorsimuscles as a function of heating time at 37℃

肌肉的pH值是反映家畜屠宰后肌肉糖原降解速率的重要指標，也是鑒定正常肉質或異常肉（PSE肉、DFD（dark, firm and dry muscle）肉）的依據[20]。由圖2可知，在37℃水浴條件下，隨著處理時間的延長，兔背肌肉和腿肌肉的pH值呈先下降后上升的趨勢，并且腿肌pH值較背肌下降幅度小且慢（P＞0.05）。背肌肉在前3 h pH值從6.34降到了5.71，這在輕度PSE肉的pH值范圍內（5.5～5.9）；腿肉在前3 h里pH值下降速度很快（P＜0.05），并達到最低pH 5.84，之后pH值稍有回升。pH值對兔肉的保水性、色澤、嫩度等都具有非常重要的影響，宰后肉的pH值下降速度過快，肉會變得柔軟多汁、肉色蒼白，風味和保水性差，這也是PSE肉具有的特征[26]。兔肉的pH值下降是由于兔宰后細胞轉變為以糖酵解的方式供能，糖酵解所產生的乳酸，以及三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）降解所產生的無機磷酸的積累，使肌肉的pH值不斷下降；3 h后，兩組試樣的pH值略有上升可能是因為肉中內源蛋白酶和微生物分泌酶的作用，使肌肉蛋白質降解為多肽和氨基酸，并釋放出堿性基團，而這些堿性物質的蓄積，使肉的pH值達到極限pH值后又逐漸回升，這與動物宰后肌肉的變化規律一致[27-28]。

2.3 色澤的變化

表4 37℃水浴條件下兔背肌和腿肌顏色的變化Table4 Changes in color parameters of rabbit rear leg and longisimus dorsi muscles as a function of heating time at 37℃

由表4可知，隨著水浴時間的延長，兔背肌和腿肌的L*值逐漸增加（P＜0.05）；a*值不斷減?。≒＜0.05）；b*值逐漸增大（P＜0.05）。結果表明：處理時間越長，a*值越低、L*值和b*值越高；隨著處理時間的延長，兔肉越來越不新鮮，肉色發白，這與Zhu等[7]研究宰后早期高溫誘導對火雞PSE肉發生的影響中色澤的變化趨勢一致。L*值的改變可能是由于高溫使得蛋白質發生變性，肉表面的水分滲出，增強了肉表面對光線的反射作用引起的；a*值下降一方面與色素物質的流失有關，另一方面是因為肌肉色素蛋白在貯藏過程中發生了變性，肌紅蛋白氧化生成其他的衍生物[29]； b*值的上升主要與脂肪氧化有關[30-31]。

2.4 失水率的變化

由圖3可知，在37℃水浴條件下，兔背肌肉和腿肌肉隨著時間的變化失水率逐漸增大，顯著高于正常肉（P＜0.05）。在整個水浴過程中，背肌肉的汁液損失顯著高于腿肉，說明背最長肌的保水性較腿肉差。試樣汁液損失高于正常肉的原因是高溫水浴環境和低pH值引起肌肉蛋白變性或降解，持水能力下降，在外力作用下內汁外滲造成汁液損失，同時肌肉收縮，肌絲間空隙減小，水分從細胞滲出并且以水滴的形式流失[7,20]。

圖3 37℃水浴條件下兔背肌和腿肌汁液損失率的變化Fig.3 Changes in water loss rate of rabbit rear leg and longissimus dorsi muscles as a function of heating time at 37℃

2.5 彈性的變化

圖4 37℃水浴條件下兔背肌和腿肌彈性的變化Fig.4 Changes in elasticity of rabbit rear leg and longissimus dorsi muscles as a function of heating time at 37℃

由圖4可知，在37℃條件下，兔背肌肉彈性隨處理時間的延長呈顯著下降趨勢（P＜0.05），在3 h內背肌肉彈性下降了13.56%；兔腿肉彈性隨著時間的變化緩慢下降（P＞0.05），在3 h內腿肌肉彈性下降了5.56%。肉的彈性是判斷PSE肉的重要指標之一，彈性的下降也表明了試樣具備了PSE肉的特征。

2.6 溶解度的變化

圖5 37℃水浴條件下兔背肌和腿肌溶解度的變化Fig.5 Changes in protein solubility of rabbit rear leg and longissimus dorsi muscles as a function of heating time at 37℃

由圖5可知，兔背肌肉和腿肌肉的肌原纖維蛋白溶解度隨著處理時間的延長均呈下降的趨勢（P＜0.05）。水浴2 h后，兩組試樣的肌原纖維蛋白的溶解度分別下降到32.75%、42.18%，分別下降了63.88%、55.06%； 3～5 h背肌肉的溶解度緩慢降低（P＞0.05）。肉類中肌原纖維蛋白的溶解度與pH值密切相關，其大小反映了蛋白質的變性程度，且其與肉的嫩度呈正相關[32]。在前2 h內兩試樣蛋白質的溶解度降低一方面是由于處理前期兔背肌肉和腿肌肉的pH值下降速度較快，肌肉進入僵直期，此時的pH值接近蛋白質的等電點，蛋白結構重新折疊，表面凈電荷幾乎為零，蛋白質相互吸引，使得蛋白質溶解度下降；另外，高溫水浴環境激活了腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine 5’-monophosphate（AMP）-activated protein kinase，AMPK）蛋白激酶的活性，加速了糖酵解，使得pH值迅速下降，肌肉蛋白變性或降解，蛋白質溶解度下降[7,33]。

2.7 流變學性質的變化

圖6 兔背肌正常肉和PSSEE 肉 G’的變化Fig.6 Changes in G’ of RFN and PSE rabbit longissimus dorsi muscle

圖7 兔腿肌正常肉和PSSEE 肉 G’的變化Fig.7 Changes in G’ of RFN and PSE rabbit rear leg muscle

儲能模量（G’）是衡量蛋白凝膠能力的一個重要指標，G’值高意味著凝膠能力強。由圖6、7可知，未經水浴處理的背肌肉的G′值隨溫度的升高而緩慢上升，當溫度為49.6℃時，背肌肉開始變性，此時的G′為91.73 Pa；2、3、5 h水浴處理后背肌的G′值的變化趨勢與未經處理的背肌肉一致，但水浴2 h后，背肌肉的變性溫度降為44.0℃，G′為54.97 Pa，兔背肌開始表現出PSE肉的特征。兔腿肌的儲能模量與背肌的變化趨勢相似，處理3 h，腿肌肉在41.8℃時開始出現明顯變性特征，此時的G’為1.35 Pa。兔背肌和腿肌G’的變化趨勢都與孫皓等[34]研究雞肉類PSE肉與正常肉流變、質構特性的比較中G′的變化趨勢一致。

高溫處理后，背肌肉和腿肌肉肌原纖維蛋白的變性溫度均低于0 h的變性溫度，且G′也比0 h的低，這是由于高溫處理引起肌原纖維蛋白質變性，蛋白質的穩定性發生了變化；在各溫度點背肌的儲能模量均小于0 h肉的儲能模量，這是因為蛋白質變性，分子間產生交聯的能力下降，凝膠性能變差[17,35]。本實驗結果表明高溫水浴時間越長，兔背肌和腿肉的變性溫度越低，G’值越小，形成凝膠能力越弱；反之，處理時間越短，G’值就越大，形成凝膠的能力越強。

3 結 論

在37℃條件下，隨著保溫時間的延長，兔背最長肌和腿肌肉的感官品質、pH值、色澤、失水率、彈性、肌原纖維蛋白溶解度以及流變學性質均發生了明顯的變化。保溫2 h后，背肌的肉色蒼白， L*值顯著增大，a*值降低，pH值迅速下降，失水率升高，彈性降低，蛋白質溶解度下降幅度大，G’值較低，凝膠形成能力差；處理3 h后，腿肌肉的肉色發白，L*值上升幅度大，a*值迅速下降，pH值下降，失水率升高，蛋白質溶解度降低。

水浴2 h時，兔背肌肉的極限pH＜5.74，L*＞63.40，汁液損失率＞25.36%；3 h時，兔腿肌肉的極限pH＜5.84，L*＞56.82，汁液損失率＞17.85%。在37℃保溫2 h，兔背肌肉表現出了PSE肉的特征，在37℃保溫3 h，兔腿肌肉表現出了PSE肉的特征。所有這些理化指標表明在高溫條件下制備出了兔PSE肉，且兔腿肉比背肌更具有PSE的典型特征，用兔腿肉更容易得可靠的PSE肉。

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