異紫堇定堿對人宮頸癌Siha細胞增殖影響的實驗研究*

王 芳 王玉歡 劉 斌 梁耀軍 張寶平

異紫堇定堿對人宮頸癌Siha細胞增殖影響的實驗研究*

王 芳①王玉歡②劉 斌③梁耀軍①張寶平④

目的：探討異紫堇定堿（Isocorydione）對人宮頸癌Siha細胞增殖的影響。方法：以100、200、400、800、1 200 μmol/L濃度的異紫堇定堿對人宮頸癌Siha細胞體外干預，分別作用24、48、72 h后，采用MTT法檢測異紫堇定堿對人宮頸癌Siha細胞生長增殖的作用；流式細胞儀檢測異紫堇定堿對人宮頸癌Siha細胞周期的影響；結合Hoechst染色觀察處理后Siha細胞核微形態的變化；Western Blot法檢測異紫堇定堿對人宮頸癌Siha細胞作用后凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3表達的影響。結果：MTT結果顯示不同濃度的異紫堇定堿作用于人宮頸癌Siha細胞后具有明顯的抑制其增殖的作用，呈劑量-時間依賴關系（P＜0.05）；流式細胞儀檢測結果顯示400 μmol/L的異紫堇定堿作用于人宮頸癌Siha細胞后，細胞周期發生明顯改變，其中G1和S期細胞比例變化不明顯，但G2期細胞明顯減少（P＜0.05）；Hoechst染色結果顯示，與對照組比較，400 μmol/L的異紫堇定堿作用于Siha細胞48 h后形態縮小、細胞核固縮，出現核碎裂形成凋亡小體；Western Blot結果顯示400 μmol/L的異紫堇定堿分別作用于人宮頸癌Siha細胞24、48、72 h后，其Bax蛋白表達增加，而Bcl-2蛋白表達逐漸減少，Bax/Bcl-2比值增加，Caspase-3蛋白表達逐漸增多。結論：異紫堇定堿對人宮頸癌Siha細胞增殖具有明顯的抑制作用，其促使細胞發生凋亡行為可能與線粒體凋亡途徑的蛋白有關。

異紫堇定堿 人宮頸癌Siha細胞 生長抑制 凋亡

異紫堇定堿是從罌粟科禿瘡花屬植物禿瘡花（Dicranostigma Leptopodum（Maxim.）Fedde，DLF）又名紅茂草（Herba dieranostigmae）中分離得到的一種異喹啉類生物堿單體，已有研究證實，其藥理活性成分具有抗腫瘤、抑菌、抗溶血、清除自由基、改善微循環以及提高機體免疫力等作用［1-5］。HPV是人類感染的主要病毒之一，研究證實宮頸癌的發生與HPV感染密切相關，尤其高危型HPV16，18兩個亞型。以往傳統的治療手段對于HPV感染宮頸癌患者存在一定缺陷性，因此，在研究宮頸癌臨床治療過程中，尋找特異性的抗HPV藥物具有至關重要的意義。且目前有關異紫堇定堿對感染不同亞型HPV的宮頸癌抑制作用方面的研究鮮見報道。本實驗將探討異紫堇定堿對人宮頸癌Siha HPV16（+）細胞增殖的影響，以尋求新型的抗HPV感染的宮頸癌臨床治療藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 異紫堇定堿單體由中國科學院蘭州化學物理所柳軍璽研究員惠贈。RPMI-1640培養液、胰蛋白酶（美國Gibico公司），96孔培養板（Nunc）；新生胎牛血清（購自杭州四季青生物工程材料有限公司）；四甲基偶氮唑鹽（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）（美國Sigma公司）；細胞周期檢測試劑PI（購自Invitrogen公司）；RIPA裂解液（Beyotime）；Western Blot一抗Bcl-2（1：500），Bax（1：500）（購自Bioworld公司，Caspase-3 CST公司）（1：1 000），山羊抗小鼠以及山羊抗兔二抗均購自北京中杉金橋生物科技有限公司。

1.1.2 儀器設備 Heal Force-Mini型超凈工作臺，細胞培養箱（日本Sanyo，MC0-18AIC（UV）），倒置熒光顯微鏡Olymous X-81，流式細胞儀（BD FACS Calibur Cell Sorting System），酶聯免疫監測儀（Bio-Rad Model 680），Western Blot實驗儀器全為Bio-Rad公司Mini型電泳轉印儀器。

1.1.3 細胞株 人宮頸癌Siha細胞HPV16（+）（Cat：TCHu113）購自中國科學院上海細胞所。

1.2 方法

1.2.1 體外細胞培養 人宮頸癌Siha細胞培養于含10%新生胎牛血清+RPMI-1640培養液中，置于5% CO2、37℃、95%飽和濕度的恒溫密閉孵箱中進行常規培養，每天觀察細胞的生長情況，細胞貼壁80%～90%時傳代，約2～3d傳代1次。

1.2.2 形態學觀察 光學顯微鏡分別對傳2～3代的人宮頸癌Siha細胞以及經不同濃度的異紫堇定堿處理不同時間點的細胞進行形態學觀察，通過判定細胞形態、生長方式、細胞折光率以及貼壁率等一系列形態學改變特征判定其產生的直觀影響。

1.2.3 MTT法檢測細胞生長抑制率 取對數生長期的人宮頸癌Siha細胞，0.25%胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液，以5×104個/mL的密度接種于96孔培養板，每孔總體系為200 μL。實驗組分別加入濃度為100、200、400、800、1 200 μmol/L用無血清培養基稀釋的異紫堇定堿。每個濃度組設6個復孔，用1640培養液200 μL設為調零點，加入不含異紫堇定堿的細胞培養液（細胞液、培養液各為100 μL）為空白對照組，將各組細胞繼續培養24、48、72 h后，換無血清培養液，并加入MTT 20 μL繼續培養4 h后棄去培養液，每孔加DMSO 150 μL/孔，振蕩10 min，置Bio-Rad Model 680酶標儀操作界面下選擇波長490 nm測定吸光值（A值），計算各組細胞的生長抑制率，按公式細胞抑制率=（1-實驗組A/對照組A×100%），計算細胞抑制率。實驗重復3次。

1.2.4 PI染色標記，流式細胞儀檢測Siha細胞周期變化 收集經異紫堇定堿作用后的人宮頸癌Siha細胞，按照Invitrogen流式細胞試劑盒的說明書進行樣品準備，實驗結果由流式細胞儀給出，并分析各組細胞周期變化。

1.2.5 Hoechst 33342染色觀察Siha細胞凋亡微形態改變 應用Hoechst 33342熒光染料對異紫堇定堿作用后的人宮頸癌Siha細胞進行染色并觀察。將2.5× 106密度細胞接種入24孔板內進行爬片，培養24 h后，刺激細胞發生凋亡后，吸出培養基，加入0.5 mL固定液，4℃過夜固定，棄固定液，PBS清洗3次，每次搖床搖蕩5 min，再加入0.5 mL Hoechst 33342染色液，染色5 min，棄染色液，PBS清洗3次，每次5 min，吸盡液體，滴加抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細胞的蓋玻片，讓細胞接觸封片液，在激發波長350 nm左右，發射波長460 nm左右的熒光顯微鏡下觀察細胞核微形態變化。

1.2.6 Western Blot法檢測Siha細胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達 用RIPA裂解液提取人宮頸癌Siha細胞總蛋白，蛋白定量采用BCA法，以BSA作為標準對照。在570 nm波長處測其吸光度值，計算樣品中的蛋白含量。60 μg的總蛋白樣品被置于100℃沸水煮7 min進行變性。蛋白電泳用80V跑凝縮膠，100V跑分離膠，轉膜采用200mA恒流1～2 h；或者100V電壓，冰水浴1 h，具體根據蛋白分子量的大小決定。轉完膜后用TBST清洗1次，加入5%脫脂奶粉封閉緩沖溶液，輕輕搖動2 h。棄掉5%封閉緩沖溶液，分別孵育Bax（1：500）、Bcl-2（1：500）、Caspase-3（1：1 000）一抗，4℃過夜。從抗體中取出PVDF膜，用TBST清洗3次，每次搖床搖動10 min，TBS洗2次，每次10 min；將膜放入適量的二抗中。室溫輕輕搖動2 h，再用TBST液清洗3次，每次10 min，TBS洗2次，每次10 min。取出膜并輕輕吸取多余水分，按一定的比例加入化學發光液，用ChemiDocTMXRS+System with Image LabTMSoftware成像，蛋白條帶判定由預染分子量的Marker提供參考。Western Blot結果用Image-pro plus 6.0軟件分析各條帶的IOD值。

1.3 統計學分析

數據用SPSS 18.0統計軟件分析，采用單因素方差分析進行比較，結果采用±s表示，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 形態學觀察

實驗組細胞經異紫堇定堿干預分別作用24、48、72 h后，肉眼均可見有細胞脫落，部分懸浮在培養液中。光鏡下見細胞變圓，體積縮小，細胞質內可見較多顆粒，顏色加深，呈深褐色，核顏色也加深，折光性增強；而對照組細胞則貼壁生長良好，形態正常，幾乎無脫落，光鏡下見細胞長梭形，胞質飽滿，相鄰細胞生長融合成片（圖1）。

圖1 光學顯微鏡觀察Siha細胞形態變化（×200）Figure 1 Changes in the morphology of SiHa cells by optical microscopy

2.2 異紫堇定堿對人宮頸癌Siha細胞增殖抑制作用

異紫堇定堿以時間劑量依賴方式抑制細胞的增殖，濃度100、200、400、800、1 200 μmol/L的異紫堇定堿對細胞均有明顯的抑制作用，其中24 h抑制率分別為：0、2.13%、10.3%、39.7%、44.5%；48 h抑制率則為：8.6%、11.9%、21.3%、54.1%、60.4%；72 h抑制率為：14.8%、28.9%、47.5%、69.7%、76.4%；且隨著培養液中異紫堇定堿濃度的增加和培養時間的延長，抑制作用也逐漸增強，呈現時間與濃度依賴性；此外，細胞的存活能力與異紫堇定堿的濃度也存在依賴關系。與對照組相比較，統計學結果顯示不同時間點之間具有顯著性差異（P＜0.05），不同濃度之間也存在顯著性差異（P＜0.05，圖2）。

圖2 MTT檢測異紫堇定堿對人宮頸癌Siha細胞增殖抑制作用Figure 2 MTT assay shows the inhibitory action of SiHa human cervical carcinoma cells[HPV(+)]and CHO cells[HPV(-)]after treatment with isocorydine

2.3 PI染色流式細胞儀檢測細胞周期的改變

異紫堇定堿對人宮頸癌Siha細胞周期的影響不同濃度的異紫堇定堿作用人宮頸癌Siha細胞24，48，72 h后，細胞周期發生率明顯改變，其中G1期和S期細胞比例未見明顯變化，而以G2期細胞減少最為顯著，且隨著異紫堇定堿濃度的增加和作用時間的延長，G2期細胞減少率也明顯增強，與對照組相比具有顯著性差異（P＜0.05）。這說明異紫堇定堿誘導人宮頸癌Siha細胞具有明顯的周期依賴性，在同一時間段，隨藥物濃度的增加細胞周期改變明顯，二者呈正相關（P＜0.01）。同一濃度不同時間段（24，48，72 h）細胞的G2期減少的幅度率逐漸增強（圖3）。

圖3 異紫堇定堿對人宮頸癌Siha細胞周期的干預作用Figure 3 Changes in the cell cycle of SiHa human cervical carcinoma cell lines after isocorydione intervention

2.4 Heochst 33342染色觀察細胞核微形態的變化

Hoechst染色結果顯示：未干預的Siha細胞核形態規則，染色均一，藍染較淡；經400 μmol/L Isocorydione的處理48 h后，與對照組相比細胞形態縮小、不規則，細胞核固縮或碎裂為小核，形成凋亡小體（圖4）。

圖4 異紫堇定堿對人宮頸癌Siha細胞微形態的影響（×400）Figure 4 Micromorphologic effects of SiHa human cervical carcinoma cell lines after isocorydione treatment

2.5 Western Blot檢測Bcl-2、Bax、Caspase-3的蛋白表達

以400 μmol/L的異紫堇定堿作用24，48，72 h Siha細胞后，凋亡相關蛋白Bax、Caspase-3蛋白表達均增加，Bcl-2蛋白表達則減少，而Bax/Bcl-2的比值增加（圖5）。

圖5 異紫堇定堿對人宮頸癌Siha細胞中凋亡相關蛋白表達的影響Figure 5 Expression of apoptosis-related proteins in SiHa human cervical carcinoma cell lines after isocorydione intervention

3 討論

宮頸癌的發病與HPV感染密切相關［1-2，6-11］，研究表明，70%的宮頸癌是由HPV16和HPV18引起［12-13］。而HPV16、HPV18及其亞型，也被稱為宮頸癌發生的高危亞型。但目前臨床仍然沒有針對HPV陽性宮頸癌治療有效的靶向藥物，由于傳統中草藥物所具有抗HPV感染及抗腫瘤的藥理活性［14-15］，這為宮頸癌臨床藥物治療提供了一種可供選擇的途徑。有諸多研究報道［1，3-5］，異紫堇定堿具有抗肝癌、抑菌、抗溶血、清除自由基、改善心肌微循環以及提高荷瘤小鼠免疫力等作用，鑒于異紫堇定堿上述的藥理活性作用以及在抗HPV感染及人宮頸癌作用機理等方面研究報道的不明確。

本實驗采用HPV16陽性人宮頸癌Siha細胞，探討異紫堇定堿對人宮頸癌Siha細胞增殖的作用。形態學結果顯示異紫堇定堿能使人宮頸癌Siha細胞變圓，體積縮小，部分脫落，細胞質內可見較多顆粒，顏色加深，呈深褐色，核顏色也加深；MTT檢測結果顯示：異紫堇定堿對人宮頸Siha細胞具有明顯的抑制作用，且呈現時間-效應依賴關系；細胞周期檢測結果顯示：異紫堇定堿作用人宮頸癌Siha細胞后，細胞周期發生率明顯改變，其中G2期細胞比例明顯減少，且隨著異紫堇定堿濃度的增大和作用時間的延長，其細胞比例也明顯減少；Western Blot法檢測結果顯示：異紫堇定堿作用人宮頸癌Siha細胞24，48，72 h，Bax蛋白表達增加，而Bcl-2蛋白表達減少，Bax/Bcl-2的比值增加，Caspase-3蛋白表達增加；且隨著時間和藥物劑量的增加，Bax蛋白也表達增加，而Bcl-2蛋白表達減少，Bax/Bcl-2的比值增加，Caspase-3蛋白表達增加。Yazan等［16］研究發現，從茴香花里提取的百里醌通過下調Bcl-2基因凋亡使得Siha細胞發生凋亡。Kniazhanski等［17］研究顯示，茉莉酸甲酯通過多途徑誘導宮頸癌細胞死亡。Xu等［18］發現，血根堿能誘導宮頸癌HeLa和Siha的細胞的凋亡，引起Bcl-2蛋白表達的下調，Bax蛋白表達增加，從而抑制宮頸癌細胞的生長。上述文獻的報道與本研究結果相類似。

通過本實驗結果表明，異紫堇定堿作用于人宮頸癌Siha細胞后，可使Bcl-2蛋白表達明顯下調，而與其相反的Bax蛋白表達明顯上調；隨著時間和藥物劑量的增加，Bax/Bcl-2蛋白表達比值增加，而凋亡指數升高，凋亡執行者Caspase-3表達增加。這表明Bax/Bcl-2參與介導人宮頸癌Siha細胞的凋亡；并且還可以通過激活下游的Caspase-3，引起一系列的酶聯激活反應，從而誘導細胞發生凋亡。因此，本研究可初步推斷異紫堇定堿促使HPV16陽性的人宮頸癌Siha細胞發生凋亡的過程可能與線粒體途徑的凋亡相關蛋白有關，而本研究對于其他諸如死亡受體通路、內質網通路的凋亡途徑未涉及，考慮到臨床中目前依然沒有特別有效地針對感染不同亞型HPV的靶向抗腫瘤藥物，后期可以隨著研究的深入將異紫堇定堿研發為新型具有靶向特性的抗HPV感染的抗腫瘤臨床藥物。

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（2013-06-12收稿）

（2013-09-18修回）（本文編輯：賈樹明）

Effects of isocorydione on cell proliferation in SiHa human cervical carcinoma cell lines

Fang WANG1,Yuhuan WANG2,Bin LIU3,Yaojun LIANG1,Baoping ZHANG4

Bin LIU;E-mail:2638541021@qq.com
1The Second Hospital of Lanzhou University,Lanzhou 730030,China;2Graduate School of Gansu University of Traditional Chinese Medicine,Lanzhou 730000,China;3Lanzhou University College of Stomatology and4Biomechanics Institute of the School of Civil Engineering and Mechanics,Lanzhou 730000,China

Objective:This paper aimed to investigate the effects of isocorydinone on cell proliferation in SiHa human cervical carcinoma cell lines.Methods:Different concentrations of isocorydione(100,200,400,800,and 1200μmol/L)were used to treat SiHa human cervical carcinoma cells in vitro for 24,48,and 72 h.Methyl thiazolyl tetrazolium(MTT)assays were conducted to determine the inhibitory action of isocorydione.Flow cytometry was performed to detect the cell cycle in SiHa human cervical carcinoma cells after treatment with 400μmol/L isocorydione.Hoechst 33342 staining was used to observe the micro-morphological changes of SiHa cell nucleus after the treatment.The expression of Bcl-2,Bax,and caspase-3 proteins in cervical carcinoma SiHa cell lines was determined using western blot analysis.Results:MTT assays showed that isocorydione inhibits the proliferation of SiHa cells in a dose-and time-dependent manner(P<0.05).The flow cytometry results showed that SiHa cervical carcinoma cells treated with different concentrations of isocorydione exhibited increased cell cycle.Compared with the control group,Hoechst 33342 staining showed that SiHa cells became narrow,with nuclear pyknosis and fragmentation,and formed an apoptotic body after treatment with 400μmol/L isocorydione for 48 h.Furthermore,western blot analysis proved that isocorydione significantly inhibited the proliferation of SiHa cell lines, and the expression of Bax protein was increased.By contrast,the expression of Bcl-2 protein decreased gradually.Consequently,the ratio of Bax/Bcl-2 increased,as well as the expression of caspase-3 protein.Conclusion:Isocorydione exhibited an overt inhibitory ac-tion on SiHa cells.Isocorydione promoted the occurrence of cell apoptosis,which may be associated with related proteins of mitochondrial apoptotic pathway.

isocorydione,human cervical carcinoma SiHa cell line,growth inhibition,apoptosis

10.3969/j.issn.1000-8179.20130928

①蘭州大學第二醫院（蘭州市730000）；②甘肅省中醫學院研究生院；③蘭州大學；④蘭州大學生物力學所

*本文課題受國家重點研究發展計劃973項目基金（編號：2010CB834202）、國家自然科學青年科學基金項目（編號：30770639）、甘肅省自然科學基金（編號：0702NKDA045，0801NKDA001）和甘肅省科技支撐項目（編號：090NKCA125）資助

劉斌 2638541021@qq.com

This study was supported by the State Key Basic Research Development Program of China(973 Program;No.2010CB834202), National Natural Science Foundation of China(Key program)(No.30770639),Natural Science Foundation of Gansu Province (No.0702N KDA045;No.0801NKDA001),and Scientific and Technologic Support Program of Gansu Province(No.090NKCA125)

王芳 醫學博士，副主任醫師。研究方向為婦科腫瘤臨床治療、宮頸癌早期篩查、抗宮頸癌藥物篩選及生殖內分泌的相關基礎研究。

E-mail：wangfang@lzu.edu.cn