MALDI-TOF-MS在愛德華氏菌檢測中的應用

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（廈門出入境檢驗檢疫局，福建廈門 361026）

MALDI-TOF-MS在愛德華氏菌檢測中的應用

龔艷清，郭書林，陳信忠，楊俊萍，葉妍妍

（廈門出入境檢驗檢疫局，福建廈門 361026）

為建立快速檢測和鑒定魚類常見的愛德華氏菌的方法，采用基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）方法對來自淡水魚的遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）和鮰愛德華氏菌（E. ictaluri）進行檢測和鑒定。為測試該方法的重復性和穩定性，采用營養肉湯、BHI瓊脂、DHL和TSA等4種不同培養基，以及用肉湯分別培養24 h、36 h、48 h和72 h的菌株進行檢測，結果表明對該菌的蛋白質譜圖影響很??；冷凍保存2年的菌株，用MALDI-TOF-MS進行檢測，鑒定分值變化很小。對分離自不同水生動物的遲緩愛德華氏菌菌株進行檢測，均可得到準確的結果。表明MALDI-TOF-MS技術可以快速、準確地檢測和鑒定這兩種愛德華氏菌。

基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）；遲緩愛德華氏菌；鮰愛德華氏菌；檢測；鑒定

愛德華氏菌廣泛分布于海水和淡水中，感染各種養殖水生動物，對水產養殖危害極大。對鰻魚、鯰魚、鱔魚和其他多種動物致病，可造成嚴重經濟損失[1-3]。引起魚類發病的病原菌主要為遲緩愛德華氏菌和鮰愛德華氏菌?，F已知遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）是多種淡、海水養殖魚類的重要病原菌，引起魚類腎臟、肝臟膿瘍病灶的疾病，損失嚴重，是目前水產養殖中危害較大的病原菌[3]。該菌適應性強，能適應多種不同宿主的體內環境，除了魚類，該菌還可感染兩棲類、爬行類和哺乳類，也是愛德華氏菌屬中唯一能夠感染人類的種類，成為一種人畜共患病的病原菌；鮰愛德華氏菌（E. ictaluri）也可使魚類發病，但危害性比遲緩愛德華氏菌小，目前已報道的主要導致斑點叉尾鮰腸敗血癥，可以危害所有規格的斑點叉尾鮰，但主要影響苗種存活率，已成為美國養殖斑點叉尾鮰最主要的疾病之一。

傳統的細菌鑒定方法依據細菌的形態學和生理生化特性分析，不僅耗時長，而且由于生化特性容易受培養基、保存時間等因素的影響，常常給鑒定帶來困難。近年來快速發展的基因檢測技術在微生物鑒定方面取得了一定的應用，但由于其敏感性高，容易出現假陽性，而且對近似種的細菌鑒定還存在一些不足。因此，對一些與人和動物關系密切的病原菌還需要建立更加快速、準確、實用的檢測和鑒定方法。本研究應用基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）技術建立了檢測和鑒定兩種常見愛德華氏菌的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗菌株

本實驗所用的遲緩愛德華氏菌（編號1101）和鮰愛德華氏菌（編號HSA-1）菌株購自武漢水生生物研究所，兩株菌株經生化及分子生物學方法確認。

1.1.2 細菌培養基和生化鑒定卡

營養肉湯、BHI瓊脂、DHL瓊脂和TSA瓊脂等細菌培養基由北京陸橋技術有限公司提供；生化鑒定GN卡由法國生物梅利埃公司提供。

1.2 儀器與設備

基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜儀（MALDI Biotyper），德國布魯克公司；全自動微生物鑒定儀VITEK 2（compact 30），法國生物梅利埃公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的復活與檢測

用營養肉湯對細菌進行復活后接種于BHI和DHL培養36 h，進行MALDI-TOF-MS檢測。

1.3.1.1 樣品處理

挑取可疑單個菌落于1.5 mL的離心管中，用生理鹽水10000 r/min離心2min洗滌二次；用75%的酒精固定細菌的表面蛋白；用等量的 70%甲酸和乙腈溶解表面蛋白，10000 r/min離心2 min。

1.3.1.2 點靶

吸取1.3.2.1中的上清點靶。先點1 μL上清于樣品靶板上，同時點1 μL標準品溶液（校準靶板），待液體干后立即點1 μL基質溶劑。

1.3.1.3 質譜圖的采集和分析

應用MALDI Biotyper儀器，選擇BioTyper par的采集方法對細菌的圖譜進行采集。用標準品對儀器進行校準后，采集樣品質譜圖。應用BioTyper軟件對細菌質譜圖進行分析和鑒定。

1.3.2 重復性實驗

兩種愛德華氏菌分別接種10份營養肉湯，30℃培養24～36 h后按上述方法進行MALDI-TOFMS檢測，比較該方法得到的質譜圖和檢測結果的重復性。

1.3.3 培養基對MALDI-TOF-MS檢測的影響

分別采用肉湯、BHI、DHL和TSA瓊脂培養基，37℃培養36h后進行MALDI-TOF-MS檢測和鑒定，比較培養時間對細菌蛋白質譜圖的影響。

1.3.4 培養時間對MALDI-TOF-MS檢測的影響

用營養肉湯37℃培養，分別在24 h、36 h、48 h和72 h對菌株進行MALDI-TOF-MS檢測和鑒定，比較培養時間對細菌蛋白質譜圖的影響。

1.3.5 保存時間對MALDI-TOF-MS檢測的影響

對保存2年的菌株復活后采集質譜圖，與菌株‐70℃保存前的質譜圖進行對比，比較細菌保存時間對質譜圖的影響。

1.3.6 全自動微生物鑒定儀（VITEK）法

按照儀器的操作要求，將1.3.1中培養的單個特征性菌落種于含3.5%鹽的營養瓊脂斜面，37℃培養24～36 h。用滅菌棉簽取適量細菌用稀釋液稀釋至特定濃度，用VITEK 2 GN鑒定卡進行鑒定，并與菌株保存前的生化指標進行比對，比較其生化反應的穩定性。

1.3.7 不同來源的遲緩愛德華氏菌的MALDITOF-MS鑒定

將冷凍保存的從羅非魚、鰻魚、大菱鲆、鯉魚、牛蛙及甲魚等水生動物中分離，并經形態和生化鑒定為遲緩愛德華氏菌的20株菌株用肉湯培養液復活，進行MALDI-TOF-MS鑒定，并與菌株保存前的生化鑒定結果進行比較，判斷MALDI-TOF-MS檢測結果的準確性。

2 結果與分析

2.1 MALDI-TOF-MS檢測結果

2.1.1 MALDI Biotyper的判斷標準和鑒定結果

判斷標準是待檢細菌與數據庫中標準菌株質譜圖的符合度，用得分表示，得分愈高，說明待測菌株的譜圖同質譜庫中某一標準菌株的譜圖（質量和峰高）愈相近。分值在2.300～3.000之間，標記為（+++），可完全確認菌株鑒定結果；分值在2.000～2.299之間，標記為（++），可基本確認菌株鑒定結果；分值在1.700～1.999之間，標記為（+），該菌株鑒定為不確定結果；分值在0.000～1.699之間，標記為（-），可判斷不是該種細菌。

上述兩種愛德華氏菌經Biotyper數據庫鑒定后，與數據庫中相應的愛德華氏菌的匹配分值分別為：遲緩愛德華氏菌為2.495、鮰愛德華氏菌2.367，且兩種愛德華氏菌的質譜圖比較相似，即其具有相近的蛋白組成，以此可以與其它非愛德華氏菌進行區分。圖1為兩種愛德華氏菌在分子量5000～8500間的質譜圖，從圖中可以看出，兩種愛德華氏菌之間的質譜峰存在明顯的差異，可以進行愛德華氏菌的種間鑒別。表1為兩種愛德華氏菌在分子量5000～8500之 間 的峰值比較，從表中可以看出鮰愛德華氏 菌 在5000～8500區間有20個可讀峰值，而遲緩愛德華氏菌只有16個，缺少5384、7273、7983、8382左右的峰值。而且兩種細菌的重復性試驗結果表明，其質譜圖變化很小，表現出很好的重復性，遲緩愛德華氏菌與數據庫中Edwardsiella tarda ATCC 36.1 EGS的匹配分值均在2.45～2.495之間，與Edwardsiella tarda HL 23.1 EGS 的匹配分值均在2.35～2.392之間，與Edwardsiella tarda ATCC 35.1 EGS 的匹配分值均在2.302～2.31之間；鮰愛德華氏菌與數據庫中Edwardsiella ictaluri 885 EGS的匹配分值均在2.35～2.367之間，與Edwardsiella ictaluri DSM 13697 HAM的匹配分值均在2.046～2.1之間，說明MALDI-TOF-MS技術具有良好的重復性。

2.1.2 培養基對愛德華氏菌質譜檢測結果的影響

采用營養肉湯、BHI瓊脂、DHL瓊脂和TSA瓊脂等4種不同的培養基對愛德華氏菌進行MALDI-TOF-MS檢測，結果見表2，表明4種培養基培養的細菌均能得到良好的匹配分值，比較其蛋白質譜圖沒有明顯的差異。說明這些細菌在不同的培養基中培養，得到的MALDI-TOF-MS蛋白質譜圖基本不變，具有良好的穩定性。

2.1.3 培養時間對愛德華氏菌質譜檢測結果的影響

圖1兩種愛德華氏菌MALDI-TOF-MS圖譜

表1兩種愛德華氏菌在分子量5000～8500間的蛋白組成比較

表2愛德華氏菌在不同培養基中培養的質譜檢測結果

取培養約24 h、36 h、48 h和72 h 4個不同時間段的愛德華氏菌進行MALDI-TOF-MS檢測，結果見表3，表明不同生長階段的細菌用MALDITOF-MS檢測得到的蛋白質譜圖基本保持不變，與數據庫中相應參考菌株的匹配分值均在2.3以上，而且至少72 h內，其蛋白質譜圖沒有明顯的變化，不影響MALDI-TOF-MS檢測結果。說明這些細菌在不同生長階段得到的MALDI-TOF-MS蛋白質譜圖具有良好的穩定性。

表3不同培養時間愛德華氏菌質譜檢測結果

2.1.4 細菌冷凍保存對MALDI-TOF-MS檢測的影響

保存兩年的菌株復活后的質譜圖與保存前的質譜圖基本沒有差異，結果見圖2和圖3。鑒定分值遲緩愛德華氏菌分別為 2.491和 2.496；鮰愛德華氏菌分別為2.364和2.356。說明該方法具有很好的穩定性。

2.2 生化鑒定結果

VITEK 2 GNTest Kit鑒定卡可以對革蘭氏陰性菌的48項生化指標進行鑒定，兩株細菌的大部分生化結果一致，只在D-甘露醇、蔗糖、L-阿拉伯糖、檸檬酸鹽、H2S等生化反應上有差異，上述2株愛德華氏菌經全自動微生物鑒定儀鑒定后，均能區分開來，符合率在95-99%之間。冷凍保存兩年后的菌株的生化與保存前的生化會有差異，符合率也低于90%，如：鳥氨酸脫羧酶和賴氨酸脫羧酶保存前為陽性，保存后變為陰性，脂酶由陰性變為可疑等，說明用傳統的生化反應來鑒定細菌存在一定的缺陷。

2.3 不同來源遲緩愛德華氏菌的MALDI-TOF-MS鑒定結果

對復活的20個遲緩愛德華氏菌的菌株進行MALDI-TOF-MS鑒定，其質譜圖變化很小，與數據庫中遲緩愛德華氏菌的匹配分值都均在2.35以上，可信度很高。說明MALDI-TOF-MS技術具有很好的準確性。而VITEK對20株遲緩愛德華氏菌的鑒定值有5株只有85%，在結果判斷上可信度有所降低。

3 討論

目前針對愛德華氏菌的鑒定方法報道的有分子生物學方法、酶聯免疫法及傳統的分離培養生化鑒定法[4-14]，尚無應用MALDI-TOF-MS方法鑒定愛德華氏菌的報道，本文通過對水生動物致病的兩種常見愛德華氏菌分別應用MALDI-TOF-MS技術及傳統生化鑒定方法進行檢測，結果表明MALDI-TOF-MS在檢測時間、重復性、穩定性、準確性等方面的總體表現均優于傳統生化鑒定方法。而且不同細菌培養基培養的菌株、不同生長階段的細菌以及冷凍保存兩年后的菌株均可以用于MALDI-TOFMS檢測，得到準確的鑒定結果。

圖2保存時間對遲緩愛德華氏菌MALDI-TOF-MS圖譜的影響

圖3保存時間對鮰愛德華氏菌MALDI-TOF-MS圖譜的影響

MALDI-TOF-MS技術以細菌表面蛋白為檢測對象，通過量化分析每種細菌的表面蛋白組成，與標準參考菌株的MALDI-TOF-MS圖譜進行比較，從而得出鑒定結果。由于每種生物的蛋白組成經過長期的進化，具有很好的穩定性。細菌的蛋白組成也主要取決于遺傳因素，受培養基、培養時間以及其它培養條件等外部因素的影響很小。因此，與其他技術相比，MALDI-TOF-MS具有很好的穩定性和重復性。

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Detection and Identifcation of Edwardsiella sp. by Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry

Gong Yanqing，Guo Shulin，Chen Xinzhong，Yang Junping，Ye Yanyan
（Xiamen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Xiamen 361026）

Matrix assisted laser desorption/ionization time of fight mass spectrometry（MALDI-TOF-MS）was experimentally used to test and identify the reference strains Edwardsiella tarda and E. ictaluri isolated from freshwater fsh to establish a rapid method for detection and identifcation of Edwardsiella sp. In order to verify its stability and repeatability，the bacteria cultured in different medium such as nutrient broth，BHI agar，DHL and TSA，and in different time intervals of 24，36，48 or 72 h were tested with the mass spectrometry and little impacts were found. There were no changes of the identifcation scores of the bacteria preserved for two years using MALDI- TOF-MS. The strains of E. tarda isolated from different aquatic animals could also be exactly identifed by the method. It was shown that the MALDITOF-MS technique could be used to detect the two Edwardsiella sp. quickly and accurately.

matrix assisted laser desorption/ionization time of fight mass spectrometry（MALDI-TOF- MS）；Edwardsiella tarda；Edwardsiella ictaluri；detection；identifcation

R446.5；S941.42

：A

：1005-944X（2014）06-0089-05

國家質量監督檢驗檢疫總局公益項目（201210055）；國家質檢總局科研項目（2013IK045）

陳信忠