接種量對單增李斯特菌生長期及生長界面的影響

周小紅，李學英，楊憲時，遲 海

（中國水產科學研究院東海水產研究所，上海200090）

接種量對單增李斯特菌生長期及生長界面的影響

周小紅，李學英，楊憲時*，遲 海

（中國水產科學研究院東海水產研究所，上海200090）

為了初步了解接種量對單增李斯特菌生長狀況及生長/非生長界面的影響，本實驗對單增李斯特菌在0、4、10、25℃下通過培養菌液在600nm下的吸光光度值對其生長周期曲線分別進行了測定，并分析了不同接種量的單增李斯特菌菌液在25℃下的生長周期狀況，探討了純培養條件下不同鹽度和pH下，接種量對單增李斯特菌生長/非生長狀況的影響。結果表明：不同的溫度下，單增李斯特菌的生長周期有很大的差別；而在相同溫度下，接種量對單增李斯特菌的生長周期有較大的影響，隨著接種水平的降低，菌種生長所需的延滯時間越長，接種量為107CFU/mL時，其生長延滯期為0～4h，而當接種量減少為10CFU/mL時，其生長延滯期為0～16h；而對于單增李斯特菌的生長/非生長界面而言，接種量對其也有一定的影響，但其作用機制還有待進一步深入的研究。

單增李斯特菌，接種量，生長期，生長界面

單核細胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes，簡稱單增李斯特菌，LM）是目前國際公認的重要食源性病原菌之一，曾多次引起食物中毒事件，臨床死亡率高達20%～70%，WTO將其列為四大食源性致病菌之一[1-2]。它是一種人畜共患的致病菌，能引起人類腦膜炎、敗血癥等疾病，尤其對孕婦、新生兒、老年人以及免疫功能缺陷者具有較高的感染風險[3]。雖然發病率不高，但致死率（20%～30%）[4]遠高于其他常見食源性病原菌。雖然在國內基本還沒有爆發由單增李斯特菌引起的嚴重中毒事件，但在國外時有此類相關報道，所以引起了廣泛的關注和重視，國外對單增李斯特菌的研究也較多，但是有關接種量對單增李斯特菌生長狀況的影響還相當有限，所以本文旨在探討接種量對單增李斯特菌生長及生長/非生長狀況的影響，以期為進一步建立單增李斯特菌在純培養和實際產品中的生長/非生長模型奠定基礎和提供參考依據。本文在0、4、10、25℃溫度下通過菌液的OD600值對單增斯特菌的生長周期進行了測定，分析了不同接種量菌液在25℃下的生長周期狀況，并探討了純培養條件下不同鹽度和pH下，接種量對單增增李斯特菌生長/非生長狀況的影響。旨在進一步建立純培養條件下不同接種量下單增李斯特菌在不同溫度、鹽度和pH下的生長/非生長界面模型，為實際產品中單增李斯特菌生長/非生長模型的建立提供參考依據，預測和控制單增李斯特菌在食品中的污染。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗菌種單核細胞增生李斯特菌（LM 54001） 購自中國藥品生物制品研究所；含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉湯（TSB-YE），含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆瓊脂（TSA-YE）、腦心浸液（BHI） 北京陸橋技術有限公司；鄰苯二甲酸氫鉀、硼砂、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、鹽酸等化學試劑（AR） 國藥集團化學試劑上海分公司。

ESCO CA2-4A1型操作安全柜 上海生叉儀器有限公司；YXQ-LS-50SII型全自動立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博訊實業有限公司；Sanyo M IR 150、153型恒溫培養箱 日本三洋科研設備公司；721型可見光分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司數顯；Sanyo M IR 253、553高精度低溫培養箱 日本三洋科研設備公司；pHS-3C型數顯酸度計 上海偉業儀器廠；SA-960-II SHJ-系列凈化工作臺 上海凈化設備廠；LabMASTER-aw型水分活度儀 瑞士Novasina公司；Power wave XS型酶標儀 美國Bioteck公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌懸液的準備 菌株采取斜面低溫保藏法于4℃冰箱中保藏[5]。每月移種一次，實驗前用無菌接種環挑取一至兩環加入無菌TSB-YE液體培養基中，37℃下培養至菌液濃度達到108CFU/m L[6-7]，以作為菌懸液備用。

1.2.2 單增李斯特菌在不同溫度和接種量下生長周期的測定 選擇0、4、10、25℃四個溫度，參照PMP數據庫的相關數據，通過分光光度計測定培養菌液的OD600值，分別對單增李斯特菌在該幾個溫度下的生長周期進行測定；取滅菌后的TSB-YE培養基無菌操作移取到滅菌的96孔板里，每個小孔分裝200μL，分別做四個平行[8]。將菌懸液分別稀釋到10、103、105、107CFU/m L數量級，分別吸取50μL到上述的小孔中，然后滴加50μL的無菌石蠟油并蓋上無菌塑料蓋，置于25℃恒溫箱中培養[9-10]，每兩小時取出培養板放入微孔板掃描分光光度計中讀取各孔在光波波長600nm下的OD值。

1.2.3 不同接種量下單增李斯特菌生長/非生長的測定 基于前期實驗的單因素實驗[11]以及一些相關參考文獻，選擇溫度25℃，鹽度分別為0.5%、2.5%、4.5%、6.5%、8.5%，pH分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，在接種量分別為10、103、105、107C FU/m L四個水平下對單增李斯特菌的生長與非生長狀況進行了部分因子實驗。根據實驗設計，配制TSB-YE液體培養基，調節其鹽度、pH到各實驗所需的條件下，然后將各培養基分裝到各個試管中，121℃下滅菌20m in。將菌懸液分別以10倍梯度稀釋到10、103、105、107CFU/m L的接種水平，單增李斯特菌的初始接種量通過涂布TSA-YE平板計算得到。各試管振蕩混勻后放入相應溫度的恒溫培養箱，根據前期的實驗結果，每組實驗做兩個平行，培養結束后觀察各試管的混濁度。

1.2.4 單增李斯特菌生長/非生長的判定方法 如果試管中菌液混濁度明顯，則判定其生長，并記為1；對于菌液混濁度不明顯或者有質疑的試管，則對該試管進行涂布確認，并將菌種培養48h后的菌落總數與初始接種菌數進行比較，如果最終的菌量比初始接種量多于0.5lg CFU/m L[12]，則判定單增李斯特菌生長，并記為1，否則記為0。對于實驗結果與預測結果有偏差的實驗數據，按上述方法再次進行重新測定確認，如果還是與預測結果不符，則作為異常點保留。

2 結果與分析

2.1 各溫度下單增李斯特菌的生長曲線

如圖1所示，圖（a）、（b）、（c）、（d）分別表示單增李斯特菌在0、4、10、25℃下的生長周期曲線，單增李斯菌在該四個溫度下的生長穩定期分別為12～20d、12～18d、6～8d、20～24h，由此可以看出，菌種在不同的溫度下其生長周期是不同的，一般溫度越低，生長所需的時間越長。所以在后期實驗中，可分別選擇不同溫度下單增李斯特菌對應的生長穩定期作為菌液的培養時間。

溫度作為影響微生物生長最直接的因素之一，對菌種的生長有較大的影響，因此在實際產品貯藏過程中，可以適當提高和降低貯藏溫度，再結合其他生長控制條件來控制菌種的生長。

2.2 不同接種量下單增李斯特菌的生長曲線

如圖2所示，接種量1、接種量2、接種量3、接種量4分別對應單增李斯特菌的菌液接種濃度為107、105、103、10CFU/m L，由圖2可以看出，4條生長曲線中，接種的菌液濃度越高，菌種對應的生長延滯期越短。接種量為107CFU/m L的時候，其生長延滯期為0～4h；接種量為105CFU/m L的時候，其生長延滯期為0～8h；接種量為103CFU/m L的時候，其生長延滯期為0～14h；接種量為10CFU/m L的時候，其生長延滯期為0～16h。由此可以得出，接種量對于單增李斯特菌的生長周期有很大的影響。

接種量不同的情況下，單增李斯特菌生長的延滯時間的差別，可針對實際產品中微生物污染率的不同，預測其致病性和食品的安全性。與腐敗菌達到一定數量食品才會出現問題不同，致病菌處于任何生長期就有引起中毒的潛在危險，因此對于含有潛在致病菌和產毒素菌株的食品來說，描述接種量對其生長/非生長情況具有重要的意義。

2.3 不同接種量下單增李斯特菌的生長/非生長狀況

由表1～表4可看出，在溫度為25℃的環境下，當培養基的pH≤4.5時，在鹽度為0.5%～8.5%的范圍內，接種量為10、103、105、107CFU/m L的菌液均不生長；當培養基的pH≥6.0時，在鹽度為0.5%～8.5%的范圍內，接種量為10、103、105、107CFU/m L的菌液均生長，即pH≥6.0時，鹽度和接種量對單增李斯特菌的生長基本沒什么影響；而當4.5≤pH＜6.0時，菌液的濃度低于105CFU/m L時，例如接種濃度分別為10、103CFU/m L時，接種量為10CFU/m L的菌液對鹽度和酸度的耐受性反而高于接種量為103CFU/m L的菌液，當接種菌液濃度為105CFU/m L和107CFU/m L，單增李斯特菌的生長與非生長狀況基本沒什么差異；而接種量為103CFU/m L和105CFU/m L作比較，可以看出菌液接種濃度越高，單增李斯特菌對鹽度和酸度的耐受性越強。

圖1 單增李斯特菌在0、4、10、25℃下的生長曲線Fig.1 Growth curve of Liseriamonocytogenes under 0，4，10，25℃

圖2 25℃下單增李斯特菌在接種量10、103、105、107CFU/mL下的生長曲線Fig 2 Growth curve of Liseriamonocytogenes under 25℃with inoculation level of 10，103，105，107CFU/mL

表1 25℃環境下單增李斯特菌在接種量為10CFU/mL下的生長/非生長狀況Table 1 Growth and no growth state of Liseriamonocytogenes under 25℃with inoculation level of 10CFU/mL

表2 25℃環境下單增李斯特菌在接種量為103CFU/mL下的生長/非生長狀況Table 2 Growth and no growth state of Lismonocytogenes under 25℃with inoculation level of 103CFU/mL

單增李斯特菌作為一種重要的食源性致病菌，國內外學者對其生長及生長動力學模型做了大量的研究，雖然在研究其微生物生長動力學中很少將接種量作為影響因子，但是有研究表明它可能對微生物的生長產生影響。Baranyi[13]、Baranyi和Pin[14]在其研究中表明隨著接種的細胞數的減少，接種水平達到102～103細胞數的菌液生長延滯期延長[15]。最新研究也表明接種量對于微生物開始能夠生長這種能力具有的重要性，Robinson等的報道中指出單增李斯特菌開始生長所需的細胞數在理想生長條件下為1CFU/m L，在1.8mol/L濃度的NaCl作用下增加到105CFU/m L，類似的結論在降低pH和增加化學抗菌劑濃度的研究中也有報道[16-17]。因此本實驗為了進一步了解和證實接種量對單增李斯特菌生長的影響，對其在10、103、105、107CFU/m L接種水平下的生長周期和生長/非生長狀況做了研究。

表3 25℃環境下單增李斯特菌在接種量為105CFU/mL下的生長/非生長狀況Table 3 Growth and no growth state of Liseriamonocytogenes under 25℃with inoculation level of 105CFU/mL

表4 25℃環境下單增李斯特菌在接種量為107CFU/mL下的生長/非生長狀況Table 4 Growth and no growth state of Liseriamonocytogenes under 25℃with inoculation level of 107CFU/mL

本實驗先對單增李斯特菌在0、4、10、25℃下的生長曲線進行了測定，是為下一步生長與非生長模型的建立過程中各溫度所需的培養時間提供一定的參考依據。另外接種量對單增李斯特菌生長期和生長/非生長狀況的影響，通過實驗得出結論，接種量對單增李斯特菌的生長周期有顯著的影響，隨著接種水平的降低，菌種生長所需的延滯時間越長，接種量為107CFU/m L時，其生長延滯期為0～4h，而當接種量減少為10CFU/m L時，其生長延滯期為0～16h；而對于單增李斯特菌的生長/非生長而言，接種量對其可能有一定的影響，當接種菌液濃度較低時，如10CFU/m L和103CFU/m L時，接種量低的菌液對環境的耐受性反而強于接種量高的菌液，這有可能受菌與菌之間的相互競爭影響，而當接種菌液濃度達到一定值時，接種量對其生長/非生長基本沒有什么影響，如105CFU/m L和107CFU/m L接種量時，單增李斯特菌的生長與非生長狀況基本沒什么差異，而將接種量為103CFU/m L和105CFU/m L作比較，又得出菌液接種濃度越高，單增李斯特菌對鹽度和酸度的耐受性越強，但差異也不是很明顯，所以接種量對于微生物的生長與非生長界面可能有一定的影響，但其作用機制還有待進一步深入的研究。

3 結論

實驗表明溫度不同，單增李斯特菌的生長周期有很大的差別，溫度越低，延滯期的時間越長，這對于不同溫度下確定微生物的致病性具有一定的參考意義；而在相同溫度下，接種量對單增李斯特菌的生長周期有較大的影響，隨著接種水平的降低，菌種生長所需的延滯時間越長，接種量為107CFU/m L時，其生長延滯期為0～4h，而當接種量減少為10CFU/m L時，其生長延滯期為0～16h，所以可以預測在實際產品中，致病菌的污染率不一樣，其致病性也會有一些差別；而對于單增李斯特菌的生長/非生長界面而言，接種量對其也有一定的影響，但其在純培養條件下波動性較大，變化趨勢不是特別有規律，其作用機制還有待進一步深入的研究，而且在實際產品中其生長/非生長界面情況還會更復雜，所以需要更進一步的研究和探索。

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Effect of inoculum size on grow th phase and grow th interface of Listeria monocytogenes under different cultural conditions

ZHOU Xiao-hong，LIXue-ying，YANG Xian-shi*，CHIHai
（East China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Shanghai200090，China）

To p relim inary understanding the influence of inoculation levelon g row th/no g row th interface of Listeria monocytogenes，the experiment was carried on 0，4，10，25℃under 600nm absorp tion values to determ ine its grow th phase by its turbid ity of bacteria liquid respec tively，and the g row th state of Listeria monocytogenes in different inoculum size under 25℃ was analyzed，and the effect of inoculation level on grow th/no grow th interface of Listeriamonocytogenes under pure cultivation combined w ith d ifferentsalinity and pH was d iscussed. The results showed that there was a big difference among the g row th of Listeria monocytogenes under different tem peratures.And at the same tem perature，inoculation level had a great influence on the g row th of Listeria monocytogenes.With the decrease of inoculation level，the lag phase required for bac terial g row th was p rolonged.When the inoculation level was 107CFU/m L，its lag phase was 0～4h.However，its lag phase increased to 0～16h when the inoculation level reduced to 10CFU/m L In term s of grow th/no grow th of Listeria monocytogenes，inoculum size also had certain influence on its interface，but the mechanism requires further specific studies.

Listeriamonocytogenes；inoculum size；grow th phase；g row th interface

TS201.3

A

1002-0306（2014）18-0180-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.030

2013－11－20 *通訊聯系人

周小紅（1988-），女，碩士研究生，研究方向：食品科學與工程。

農業部引進國際先進農業科學技術項目（2011-Z12）。