蛋白溶解性分析法研究大米焙炒過程中蛋白質熱變性行為

陳建新，徐　　巖

（1．江南大學工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫214122；2．江南大學糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇無錫214122；3．江南大學生物工程學院，江蘇無錫214122）

蛋白溶解性分析法研究大米焙炒過程中蛋白質熱變性行為

陳建新1，2，徐巖1，3，*

（1．江南大學工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫214122；2．江南大學糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇無錫214122；3．江南大學生物工程學院，江蘇無錫214122）

考察了焙炒過程中大米蛋白質的熱變性行為，通過大米蛋白在不同功能溶劑中的溶解度變化了解大米蛋白質在焙炒過程中次級結構的變化及熱變性信息。發現熱變性主要發生在焙炒的前期，熱變性包括蛋白質次級結構的變化和更高能級的化學變化。與傳統蒸煮方法相比，焙炒大米的蛋白質熱變性程度較低。粳米和糯米中的蛋白質熱變性行為基本相似，選用不同的加熱介質對大米蛋白的熱變性沒有影響。

焙炒，蛋白提取，大米，熱變性，蛋白溶解性

黃酒釀造時，需要將大米中的淀粉糊化和糖化最終變成葡萄糖。傳統的大米糊化方法是先浸泡后蒸飯。為了節能和減污，空氣或過熱蒸汽焙炒被用于大米的糊化[1-5]。在大米熱加工過程中，大米中的蛋白質也同時發生了熱變性。熱變性蛋白更易水解成黃酒中的營養和風味成分。

蛋白質變性實際上是它的立體構象由于外界因素的作用發生了改變，這種變化并沒有破壞蛋白質的一級結構，而是蛋白質的二級、三級或四級結構變化的結果。通常由于蛋白質構象改變后，一些活躍的基團會暴露，引起蛋白分子間的相互作用形成凝膠等，蛋白質變性會造成蛋白質性質的改變，包括物理和化學性質[6]。常用蛋白質熱變性研究的手段主要包括結構分析和熱力學分析，其中，結構分析的方法有X射線衍射法、圓二色譜法、熒光光譜法和傅立葉紅外光譜法等[7]，熱力學分析主要是利用差示掃描量熱法分析變性過程熱力學參數變化[8]。另外，也可以通過蛋白溶液消光系數隨溫度的變化研究蛋白質熱變性[9-10]。

上述研究方法有一個共同的缺點是只能用于提純蛋白質熱變性研究。蛋白質溶解性分析可以直接研究大米中蛋白質的變性行為，蛋白質提取劑是含有不同溶質的緩沖液，針對蛋白質次級結構中不同的弱化學鍵。蛋白質在不同提取劑中的溶解度變化可以反映蛋白質次級結構變化的信息，進而可以了解蛋白質的變性行為。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

大米原料一種粳米，一種糯米，均來自中國江蘇宜興市糧油集團大米有限公司，收獲于2009年，經過碾米加工，在-20℃條件下保存待用；磷酸緩沖液（PB，pH7.5）、尿素、硫脲、二硫蘇糖醇、曲拉通（Trionx-100）、3-（（3-膽固醇氨丙基）二甲基氨基）-1-丙磺酸（CHAPS）、濃硫酸、過氧化氫、硫酸銅、硫酸鉀、硒粉、氫氧化鈉、牛血清蛋白、考馬斯亮藍G-250均為分析純，均購自國藥集團。

玻璃凱氏定氮儀國藥集團；1-15PK型離心機德國西格瑪公司；F6/10型高剪切分散乳化機上海弗魯克流體機械公司；UV2000型分光光度計尤尼柯儀器有限公司；JFSD-100型粉碎機上海嘉定糧油檢測儀器廠；焙炒流化床自制；BCD-155TDGA型冰箱青島海爾股份有限公司；Free ZONE 2.5凍干機美國LABCONCO公司。

1.2大米焙炒

在流化床中分別采用過熱蒸汽，空氣在200℃下焙炒，焙炒時間分別是5、10、20、30、40s。焙炒大米經過粉碎機粉碎后，過80目篩，分裝于密封袋中，在干燥器中保存。

1.3大米蒸煮

原料大米分別浸泡1、7d，然后在常壓下蒸汽蒸飯30min，蒸煮后立刻放冰箱-20℃冷凍24h，再經過真空冷凍干燥，最后粉碎，過80目篩，分裝于密封袋中于干燥器中保存。

1.4蛋白質提取劑系統及提取方法

根據表1配制不同的提取劑用于大米蛋白質的溶解。根據溶質的功能和組成，將提取劑分為兩個系統，單一組分系統和IEF緩沖液系統。

表1　蛋白質提取劑配制表Table.1　Composition of protein extraction agent

稱取50mg米粉，加入提取劑10mL，用手持式攪拌機攪拌3min，提取2h后離心（16000r/min，15min），離心后的提取液測定蛋白質濃度。

1.5大米中總蛋白含量測定

凱氏定氮法[11]。

1.6提取液中蛋白質濃度測定

1.6.1標準曲線的制作用超純水配制100μg/mL標準BSA（牛血清蛋白）溶液。以超純水作為實驗緩沖液，分別取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8mL標準BSA溶液，分別加入1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2mL蒸餾水中，構成標準蛋白溶液。每份標準蛋白溶液中分別加入5mL考馬斯G-250溶液（考馬斯亮藍G-250溶于50mL 95%乙醇，加入100mL 85%H3PO4，加蒸餾水稀釋至1000mL），翻轉搖勻，3～5min后，依次測標準樣品在595nm下的A值（以蛋白質含量為0的做參比），每個標樣重復3次讀數，取其平均值，以蛋白質濃度為橫坐標（μg/mL），吸光度為縱坐標（y，A595），作標準曲線，建立回歸方程。

1.6.2提取液中蛋白質濃度測定取1.4所得的離心提取液0.5mL，加水混合至1mL，再加5mL考馬斯藍G-250 5mL，3min后，測595nm下樣品的A值，帶入標準曲線得出蛋白質含量。

式中，V—提取液體積，mL；cE—提取液蛋白質濃度，μg/mL；n—提取液稀釋倍數；m—樣品質量，mg；cRP—大米樣品總蛋白質含量，μg/mg。

圖1　提取液蛋白質濃度測定標準曲線及回歸方程Fig.1　Standard curve and regression equation ofprotein concentration of extract

2　結果與討論

2.1單一組分系統提取大米中的蛋白質

大米總蛋白含量的測定結果，粳米總蛋白質含量91μg/mg，糯米總蛋白質含量79μg/mg。提取液中蛋白質濃度測定的標準曲線和回歸方程均在圖1中，標準曲線的R2值為0.99，可以滿足檢測要求。測定的提取液蛋白質濃度代入式（1）即可求得大米蛋白質提取率。

單一組分系統選取的提取劑的作用分別是：PB緩沖液提取原生狀態蛋白質；尿素和硫脲主要破壞非共價鍵（氫鍵，疏水鍵）；DTT破壞二硫鍵；Triton X-100，CHAPS破壞疏水鍵[12-13]。通過測定在不同提取劑中的溶解度，可以了解大米蛋白質在加熱過程中次級結構的變化信息。

圖2　單一組分提取系統粳米蛋白提取率Fig.2　Rice protein extraction rate by single component extraction system

圖3　單一組分提取系統糯米蛋白提取率Fig.3　Glutinous rice protein extraction rate by single component extraction system

圖2～圖3分別是粳米和糯米在過熱蒸汽和空氣中焙炒大米的蛋白提取率，磷酸緩沖液提取自然狀態下的蛋白質，因此，提取率非常低。其他五種物質中，除了尿素有較高的提取率外，其他幾種溶劑僅略高于磷酸緩沖液的提取能力。說明大米中的蛋白質中未有對次級結構起決定作用的弱化學鍵，因此，認為大米蛋白質的次級結構受多種弱化學鍵共同影響，任何單一的溶劑無法大幅度提高蛋白質的提取率。

尿素對促進蛋白質的溶解有比較顯著的效果，其機理主要是打破氫鍵和疏水鍵，說明氫鍵和疏水鍵在大米蛋白的次級結構中起比較重要的作用，是保持大米的自然狀態的主要弱化學鍵。大米蛋白質在尿素中的溶解度在焙炒初期急劇下降，焙炒中期后不再發生變化，說明大米蛋白熱變性的過程主要發生在焙炒初期，熱變性過程時大米蛋白質中的氫鍵和疏水鍵同樣也發生了較大的變化。

2.2IEF緩沖液提取大米中的蛋白質

圖4、圖5分別是用IEF提取系統提取焙炒粳米和糯米蛋白的提取率。從總體上看，提取率顯著高于單一組分系統，說明需要提取劑中多組分同時破壞蛋白質中不同的弱化學鍵，蛋白質的結構才能發生變化，并溶解于溶劑中。IEF緩沖液提取系統與單一組分提取系統的最大區別是尿素的作用。在單一組分中，尿素的效果比較顯著，但在IFE提取系統中，尿素的作用并不突出。反之，DTT的作用卻相對比較大，缺少DTT的IEF緩沖液大米蛋白質的提取能力顯著下降。產生這種現象的可能原因：IEF緩沖液組分中，硫脲、曲拉通、CHAPS的作用與尿素相似，具有較強的互補性，因此，缺少尿素的IEF緩沖液仍然具有較強的大米蛋白提取能力。DTT的作用是破壞二硫鍵，并且在IEF的組分中只有DTT具備這種能力，因此，如果缺少DTT，IEF緩沖液無法破壞二硫鍵，大米蛋白質溶解能力隨之大幅下降。比較在單一組分系統中，DTT溶液提取蛋白質的能力并不強，說明DTT只有在打破氫鍵等前提下才能發揮作用，因此，與尿素或其他相似功能的物質共同使用才能提高蛋白質提取能力。反之，硫脲、曲拉通、CHAPS也只有與DTT協同作用時才表現破壞氫鍵和疏水鍵的能力。因此，多組分協同作用是提取劑提高蛋白質提取率的關鍵。

與單一組分系統相同，大米蛋白質的提取率在焙炒前期變化很大，中后期基本不變，大米蛋白質的熱變性主要發生在焙炒前期。說明大米蛋白對溫度比較敏感，而加熱時間對蛋白的變性影響不大。含水率可能對大米蛋白質的變性也有重要影響，焙炒時大米的水分不斷蒸發減少，含水量由初始時的約14%降低到最終的4%左右[4]。在焙炒初期，大米的溫度并不高，但含水率相對較大，而在中后期大米的溫度比較高但含水率比較低。而受熱時蛋白的含水率對蛋白是否發生熱變性以及變性的程度有影響。

蛋白質的熱變性一般屬于次級結構改變，但隨焙炒的進程，大米蛋白質在IEF緩沖液中的溶解度由約70%降低到約40%，說明部分蛋白質的變性不僅是次級結構中的弱化學鍵發生了變化，還發生了更高能級的化學變化，形成新的化學鍵或者蛋白質與大米中的其他成分結合成復合物等，總之，蛋白質的結構改變超出了次級結構的變化范圍。

圖4　IEF緩沖液提取系統粳米蛋白提取率Fig.4　Rice protein extraction rate by IEF buffer extraction system

圖5　IEF緩沖液提取系統糯米蛋白提取率Fig.5　Glutinous rice protein extraction rate by IEF buffer extraction system

3　討論

與傳統的濕熱加工方式相比，焙炒大米中蛋白的變性程度相對較低，而傳統的加工方式中，浸泡時間長的大米蛋白質變性程度更高。這種現象值得關注，因為焙炒是高溫、短時和低水分含量而傳統的蒸煮是低溫、長時間和高水分含量。這進一步印證了水分對蛋白熱變性的促進作用[6]，并且長時間浸泡使大米的微觀結構和蛋白質結構都發生了變化，蛋白質更容易發生熱變性。

比較糯米和粳米中蛋白質溶解度，兩者之間存在差異，這種差異是兩種大米在微觀結構和所含淀粉分子差異造成的。比較發現，過熱蒸汽和空氣對焙炒大米蛋白變性的影響不大，無論采用什么樣的加熱介質，關鍵是加熱介質對大米自身的溫度和溫度變化產生的影響，如果介質的加熱效果相同，那么大米蛋白的熱變性也就相同，與所采用加熱介質種類無關，僅與大米自身的溫度變化有關。

4　結論

4.1大米焙炒過程中，大米蛋白的熱變性發生在焙炒前期，并且變性程度較高，除了次級結構被改變以外，還有能級更高的化學鍵的變化。

4.2盡管焙炒溫度較高，但焙炒大米的蛋白質變性程度低于傳統的浸泡蒸煮大米，并且粳米與糯米的變性過程和程度基本相同，使用不同的加熱介質對大米蛋白的變性沒有影響。

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Analysis of the thermal denaturation of rice protein during roasting by protein solubility study

CHEN Jian-xin1，2，XU Yan1，3，*
（1．Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2．National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3．School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Thermal denaturation of rice protein during roasting was examined in this paper.The information about the changes of secondary structure of rice protein and thermal denaturation of rice protein was known through the solubility of rice protein changes in different solvents.It was found that the thermal denaturation occurred mainly in the early stage of roasting and thermal denaturation involved the change of protein secondary structure and the higher energy level chemical changes.Compared with the traditional cooking methods，roasted rice protein thermal denaturation degree was low.Protein denaturation degree of waxy rice and no waxy rice was similar during roasting and the effect of thermal denaturation of rice was the same using different heating medium.

roasting；protein extraction；rice；thermal denaturation；protein solubility

TS262.4

A

1002-0306（2014）06-0132-05

2013－08－02*通訊聯系人

陳建新（1965－），男，大學本科，高級工程師，研究方向：釀酒機械化。