中鏈脂肪酸的抗菌作用：辛酸對悉生鹵蟲無節幼體接種蝦致病菌哈維氏弧菌和副溶血性弧菌的抗菌作用

（印度Manonmaniam Sundaranar大學海洋科學和技術中心海洋生物技術實驗室,Rajakkamangalam,Kanyakumari區,泰米爾納德邦629502）

鹵蟲無節幼體被廣泛認為是海洋魚類和甲殼類動物孵化場最好的天然的長期可儲存的活餌料（Lavens等，1996）。這是因為鹵蟲屬擁有一些獨特的特征如體積小，容易攝食(Leger等，1986)，高營養價值(Browne等，1991)，對不同的培養環境具有高耐受力(Leger等，1987)，繁殖周期短(Reeve1963；Pwe?soone等，1980)等。鹵蟲屬也被用來作為提供營養物質的帶菌物質(Watanabae等，1983)，抗菌劑(Dixon等，1995)，疫苗(Campbell等，1993)和所有上述提到的產品都可能是通過提高原微生物菌群的特性而起到對宿主機體正效應作用。鹵蟲屬也是一個被用來研究對蝦、龍蝦和其他甲殼蟲類疾病很好的生物體模型(Overton等，1981；Verschuere等，1999，2000a)。最近在豐年蝦鹵蟲上研究顯示，在一個悉生測試系統的儀器中研究食物成分在攻毒或不攻毒情況下對豐年蝦鹵蟲存活和生長的影響(Marques等2004、2005)。最近，建立一個限菌系統，使幼蟲在無菌條件下孵化、生長，為已知的細菌與宿主-微生物相互作用的研究提供便利，尤其是鹵蟲幼體(Marques等，2006)。

游離脂肪酸對病原微生物（包括包膜病毒、衣原體和細菌）具有抑制作用(Kabara等，1972；Kabara，1978；Isaacs等，1995；Petschow等，1996；Bergsson等，1998，1999)。關于脂肪酸的抗菌性能，大多數研究都集中在中鏈和長鏈脂肪酸。雖然短鏈和中鏈脂肪酸的抗菌機制不完全明白，但是它們能夠發揮抑菌和殺菌性能取決于生物體的生理狀況和外部環境的物理化學特性(Ricke，2003)。在未解離的形式，短鏈和中鏈脂肪酸能通過細菌細胞膜和游離于堿性細胞質，從而增加了細胞內的質子濃度(Cherrington等，1991；Sun等，1998)。結果表明，細胞必須消耗能量使細胞質pH值維持在合適的水平。能量不能被用作其他代謝過程，從而抑制了細胞的生長?；谝陨弦蛩?，本研究評估了中鏈脂肪酸辛酸對哈維氏弧菌和副溶血性弧菌在體外的抗菌作用和辛酸在豐年蝦攻毒這兩種菌時的保護作用。

1 材料和方法

體外攻毒試驗參照Defoirdt等(2005)方法，100尾鹵蟲無節幼體(齡II)在孵化后被轉入到4個無菌離心管中，每個離心管中隨機分配25尾，并含有過濾和滅菌海水及10 mM的辛酸。正對照組不含辛酸。試驗介質的pH值調整到7.0。鹵蟲幼體飼喂蒸壓懸浮的嗜水氣單胞菌（LVS3）,細胞密度大約為每日107CFU/ml。飼喂前，菌株在過濾的海水中的海洋瓊脂培養液中過夜，蒸壓后加入到鹵蟲幼體培養基中。然后，離心管被分別接種105CFU/ml的哈維氏弧菌和副溶血性弧菌。離心管在28℃旋轉器中離心孵育。測定60 h內鹵蟲幼體的死亡率。每6 h測定一次每個處理的存活百分數。為了上述目的，在飼養和添加細菌前通過用肉眼記錄鹵蟲幼體的數量，這都是在未打開并暴露在白熾燈下和維持悉生環境的透明的離心管中進行的。鹵蟲無節幼體的累計死亡率指數(CMI)通過每次間隔記錄的死亡數的總和來計算(Immanuel等2001,2004,2007)，公式：

CMI=Dx1+Dx2+Dx3…Dxn。

D是x1，x2，x3…xn每次的死亡個數。

2 結果

2.1 第一個試驗：測定不同濃度的辛酸(1、10和100 mM)對病原菌哈維氏弧菌和副溶血性弧菌生長的影響(圖1)

圖1 不同濃度辛酸和不同時間間隔對哈維氏弧菌和副溶血性弧菌生長的影響

對照組，病原體的生長直到試驗結束。在高濃度辛酸組(100 mM)，兩種菌在5 h內被完全抑制。但當辛酸1 mM和10 mM濃度時，病原菌的生長沒有被完全抑制。

2.2 第二個試驗：pH值不同時辛酸對哈維氏弧菌和副溶血性弧菌生長的影響

測定pH值為5、6、7辛酸濃度為10 mM時對哈維氏弧菌和副溶血性弧菌的抑制作用（圖2）。與pH值6、7（43%~46%）時相比，pH值為5（65%~80%）時辛酸對抑制兩種菌生長的作用最強。

圖210 mM辛酸在不同pH值條件下和不同時間間隔對哈維氏弧菌和副溶血性弧菌生長的影響

2.3 第三個實驗：體外攻毒實驗

給鹵蟲無節幼體接種哈維氏弧菌和副溶血性弧菌，在攻毒試驗期間從接種病毒開始到第6 h時死亡（表1）。在6 h期間，正對照組(無辛酸組)在攻毒哈維氏弧菌和副溶血性弧菌后其死亡率分別為23.3%和21.65%。同時，試驗組即添加辛酸組死亡率分別為20%和16.65%。以此同時，負對照組(無病原菌和辛酸)無死亡率。

表1 添加10 mM辛酸pH值為7的培養基中攻毒哈維氏弧菌和副溶血性弧菌的鹵蟲無節幼體的累積死亡百分數

鹵蟲無節幼體在分別攻毒兩種菌時的死亡率百分數隨著攻毒時間的延長呈線性增加。60 h內，正對照組攻毒兩種菌后死亡率為100%。但是在添加10 mM辛酸的試驗組，攻毒哈維氏弧菌和副溶血性弧菌的鹵蟲無節幼體的死亡率分別為79%和76%。同時，負對照組的死亡率只有17%。統計分析表明，在試驗期（60 h）各組間的累積死亡率差異顯著（P<0.05）。

2.4 CMI和降低的死亡率

攻毒哈維氏弧菌的正對照組的鹵蟲無節幼體的累計死亡率指數(CMI)為24 692.76，加10 mM辛酸后死亡率降低到16.3%，負對照為84.55%(表2)。

表2 不同處理組的CMI和降低死亡率的百分數

同樣，攻毒副溶血性弧菌的正對照組的鹵蟲無節幼體的累計死亡率指數(CMI)為23 599.20，加10 mM辛酸后死亡率降低到20.61%，負對照為83.84%。通過t檢驗統計分析各組間的CMI呈顯著性差異(P<0.05)。

3 討論

脂肪酸已被開發作為幾個世紀的抗菌劑(Sun等，2002；Hogan等，1987；Wang等，1992；Petschow等，1996)。本試驗，我們研究不同濃度的辛酸(1、10和100 mM)對哈維氏弧菌和副溶血性弧菌在pH值為6時的抗菌效果。在100 mM濃度、5 h時100%完全抑制病菌的生長。但是當辛酸濃度為1 mM和10 mM時的抑菌效果所需時間延長。與本研究報道一致的是Defoirdt等(2006)報道不同濃度的短鏈脂肪酸例如甲酸、乙酸、丙酸、丁酸和戊酸(1、10和100 mM)在pH值為6時對坎氏弧菌的生長抑制的影響。進一步研究表明，當辛酸濃度為100 mM時，所有的短鏈脂肪酸都顯示出對坎氏弧菌生長100%抑制，然而在其他兩個濃度時無效果。根據上述調查結果，Wolin(1969)報道，在pH值為6、10 mM的短鏈揮發性脂肪酸部分抑制大腸桿菌的生長。相似地，Van Immerseel等(2003)也報道，在同樣的pH值條件下，辛酸為100 mM時短鏈脂肪酸完全抑制腸炎沙門氏菌。

此研究還揭示辛酸對蝦病原菌生長抑制活性的pH值依賴性。在最低pH值為5時，生長抑制最高，然而在高pH值(6和7)時生長抑制相對較低(42%~46%)。Defoirdt等(2006)報道，短鏈脂肪酸(甲酸、乙酸、丙酸、丁酸和戊酸)對坎氏弧菌的生長抑制作用也具有pH值依賴性。他們指出pH值為5時，生長被完全抑制，然而在pH值為6時，生長抑制被推遲，在pH值為7時無抑制效果。本研究結果與Wolin(1969)，Mc Han等(1993)和Van Immerseel等(2003)研究在不同pH值條件下短鏈脂肪酸對大腸桿菌和腸炎沙門氏菌生長抑制效果的結果存在相關性。生長抑制效果依賴pH值的原因實際上是因為在低pH值時，占主導地位的未解離的脂肪酸能通過細胞膜(Sun等，1998)。

本研究中，體外攻毒試驗結果表明，鹵蟲無節幼體在分別攻毒副溶血性弧菌和哈維氏弧菌后的試驗組的死亡率是非常低的(分別是20.61%和16.30%)。Defoirdt等(2006)也報道在攻毒坎氏弧菌后，鹵蟲幼體最好存活率組是添加了20 mM的短鏈脂肪酸(甲酸、乙酸、丙酸、丁酸和戊酸)組。他們的研究表明，在pH值7時攻毒坎氏弧菌情況，分別添加了20 mM的甲酸、乙酸、丙酸、丁酸和戊酸組的鹵蟲幼體的存活率分別為45%、48%、48%、42%和47%。此前，無論是體外和體內研究都報道辛酸對各種魚類寄生蟲具有顯著的抗寄生蟲作用。并且據觀察辛酸對魚類健康無任何有害作用(Hirazawa等，2001a，b，c)。Wang等（1992）報道，脂肪酸的抗菌作用隨著鏈長度的增加而降低，中鏈脂肪酸的抗菌作用比長鏈脂肪酸更強。相似地報道，Isaacs等（1995）指出，含有8~12個碳的脂肪酸比長鏈脂肪酸的抗病毒和抗菌效果更好。辛酸含8個碳，中鏈脂肪酸與長鏈脂肪酸相比，疏水性較低且更易溶，其殺菌效果更好。

雖然辛酸對細菌的確切抑菌機制還不清楚，但眾多的假設已經提出來解釋游離脂肪酸的一般抗菌活性模式。一種假設是短鏈和中鏈脂肪酸以它們未解離的形式擴散到細菌細胞原生質內，然后解離，從而導致細胞內酸化(Sun等，1998)。較低的細胞內pH值可導致細胞內的酶失活(Viegas等，1991)和氨基酸轉運抑制(Freese等，1973)。因為脂肪酸被認為是通過多種機制來殺死細菌的，這些分子引起潛在的細菌耐藥性可以忽略不計。Beegsson等(1999)研究表明，游離脂肪酸發揮它們對細菌生物膜的抗菌效應，因此細菌耐藥性出現的幾率是不太可能的。Kabara(1978)和Monk等(1996)也報道與革蘭氏陽性菌相比，革蘭氏陰性菌對脂肪酸的抗菌作用不太敏感?？傊?，辛酸對在限菌鹵蟲無節幼體培養基中攻毒的哈維氏弧菌和副溶血性弧菌的抗菌作用歸功于它是中鏈長度。更進一步的是，本研究結果為辛酸可以作為一種抗生素替代品替代或者輔助抗生素治療水產養殖中發生的發光弧菌病提供判斷依據。