正交試驗優化哈蟆油蛋白雙酶法水解工藝

董 穎，張 鶴，周光新，趙大慶*，趙 雨，叢德毓

（長春中醫藥大學，吉林 長春 130117）

正交試驗優化哈蟆油蛋白雙酶法水解工藝

董 穎，張 鶴，周光新，趙大慶*，趙 雨，叢德毓

（長春中醫藥大學，吉林 長春 130117）

目的：考察雙酶法制備哈 蟆油蛋白 的最佳工藝。方法：以哈蟆油為原料，采用檸檬酸浸提和水煎煮的方 法提取哈蟆油蛋白，先后加入胃蛋白酶和堿 性蛋白酶進行酶解，根據酶解后哈蟆油蛋白相對分子質量分布，應用單因素和正交試驗確定哈蟆油蛋 白酶解的最佳條件。結果：最佳酶解條件為胃蛋白酶與底物比（m/m）1∶2 000、酶解時間2 h、堿性蛋白酶與底物 比（m/m）1∶100、酶解時間6 h，酶解后哈蟆油蛋白相對分子質量小于5 000所占的比例為94.85%，哈蟆油蛋白中蛋白質含量為49.85%。結論：胃蛋白酶與堿性蛋白酶結合使用可以有效地降低哈蟆油蛋白的相對分子質量，利于人體吸收。

哈蟆油蛋白；胃蛋白酶；堿性蛋白酶；雙酶法

哈蟆油（Oviductus Ranae）是中國林蛙（Rana chensinensis）雌蛙的干燥輸卵管[1]，又稱“林蛙油”，是我國東北特產的名貴中藥[2]，具有明顯抗疲勞[3]、抗衰老[4]、抗氧化[5]、增強機體免疫力[6]、調節人體內分泌等多種保健作用[7]。哈蟆油中主要含有蛋白質、氨基酸、脂肪酸、磷脂、激素及微量元素等多種成分[8]，其中蛋白質約占總量的一半以上[9]。哈蟆油中黏蛋白屬于高度糖基化的大分子糖蛋白[10-12]，相對分子質量在3×106～40×106之間[13]，遇水易膨脹，膨脹度大于55[1]，且黏稠度較大，既不利于人體消化吸收，也不利于加工生產[14]。目前，市場主要以哈蟆油粗加工產品為主[15]，哈蟆油中多數成分不易被人體吸收。哈蟆油采用檸檬酸浸提和熱水提取過程中，黏蛋白經酸解和熱解后，其相對分子質量有所降低，但仍在幾十萬至幾百萬，水溶性較差，需進一步采用蛋白酶進行酶解。本實驗采用胃蛋白酶和堿性蛋白酶雙酶法制備哈蟆油蛋白，可以明顯降低哈蟆油蛋白的相對分子質量，使哈蟆油蛋白更易被人體消化和吸收，提高了哈蟆油的營養價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

哈蟆油：由吉林省白山市北亞藥業提供，經長春中醫藥大學中藥鑒定教研室李宜平教授鑒定為中國林蛙Rana chensinensis雌蛙的干燥輸卵管；胃蛋白酶、堿性蛋白酶 北京鼎國生物技術有限責任公司；凝膠色譜柱標準相對分子質量試劑（相對分子質量依次：6 500、13 700、29 000、43 000、75 000、158 000、440 000、669 000） GE Healthcare公司；NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·2H2O、Na2SO4美國Fluka公司；其他試劑均為國產分析純試劑。

1.2 儀器與設備

1100型高效液相色譜儀 美國Aglient公司；TSKgelG2 000SW（XL）凝膠色譜柱 日本Tosoh公司；Uvmini-1240紫外分光光度計 島津儀器有限公司；PL230電子天平、PHS-25數顯酸度計 梅特勒-托利多儀器有限公司；WFO烘箱 上海愛郎儀器有限公司；LL3000凍干機 瑞典Jouna Nordi c公司。

1.3 方法

1.3.1 哈蟆油原料預處理

哈蟆油去除筋膜等雜質后，置于陰涼處晾干，粉碎成細粉，-20℃冰箱保存。

1.3.2 哈蟆油總蛋白的提取

稱取1.0 g哈蟆油細粉，按料液比（g/mL）1∶100加入pH 4.5的檸檬酸溶液100 mL，浸泡36 h，勻漿后加入2 000 mL蒸餾水，煎煮2 h，冷卻至室溫，用10 mmol/L HCl溶液調pH 2.89，定容至200 mL，哈蟆油蛋白質量濃度為5 mg/mL，備用。

1.3.3 胃蛋白酶和堿性蛋白酶的酶解條件

取5 mg/mL的哈蟆油蛋白提取液，首先加入適量的0.1 mg/mL胃蛋白酶溶液，放入烘箱中37 ℃加熱酶解，酶解后樣品煮沸15 min，使酶失活，放至室溫，然后用10 mmol/L NaOH溶液調節pH 9.0～10.0，再繼續加入適量的1 mg/mL堿性蛋白酶溶液，烘箱中55 ℃進行二次酶解，酶解后樣品煮沸15 min，使酶失活，放至室溫，調節pH 6.8～7.2，取樣400 ?L，0.22 ?m濾膜過濾，備用。

1.3.4 哈蟆油蛋白相對分子質量測定

采用高效液相凝膠色譜法，根據酶解后哈蟆油蛋白相對分子質量分布情況進行評價。

相對分子質量小于5 000所占的比例/%=相對分子質量小于5 000所占的峰面積/總峰面積×100

1.3.5 高效凝膠色譜條件

流動相為0.08 mol/L NaH2PO4·2H2O、0.08 mol/L Na2HPO4·2H2O、0.08 mol/L Na2SO4，pH 6.8；流速為1 mL/min；進樣量為20 μL；檢測波長為270 nm。

1.3.6 哈蟆油蛋白中蛋白質含量測定

采用紫外分光光度法測定哈蟆油蛋白中蛋白質含量[16]。制作氮含量(x，μg/mL）與吸光度（y）的標準曲線方程，回歸方程為y=0.069 8x-0.002 2，R2=0.999 1，依據回歸方程計算出樣品中的含氮量，根據含氮量乘以蛋白質換算系數得出哈蟆油蛋白中蛋白質質量。

哈蟆油蛋白中蛋白質含量/%=哈蟆油蛋白中蛋白質量/哈蟆油蛋白質量×100

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 胃蛋白酶加酶量的確定

取10 mL哈蟆油蛋白溶液（5 mg/mL）5 份，選取胃蛋白酶與底物比（m/m，下同）分別為1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶5 000、1∶10 000加胃蛋白酶溶液，37 ℃酶解3 h。然后再選取堿性蛋白酶與底物比（m/m，下同）為1∶250加堿性蛋白酶溶液，55 ℃酶解4 h，考察胃蛋白酶不同酶量對哈蟆油蛋白相對分子質量分布的影響。

圖1 胃蛋白酶不同加酶量對哈蟆油蛋白相對分子質量的影響Fig.1 Effect of different doses of pepsin on the percentage of peptideswith molecular weight less than 5 000 in hydrolysate

從圖1可以看出，隨著胃蛋白酶用量的增加，哈蟆油蛋白相對分子質量小于5 000所占比例逐漸增加，在酶與底物比1∶2 000以后，相對分子質量小于5 000所占比例變化較小，因此選擇酶與底物比為1∶2 000。

2.1.2 胃蛋白酶酶解時間的確定

圖2 胃蛋白酶不同酶解時間對哈蟆油蛋白相對分子質量的影響Fig.2 Effect of different pepsin hydrolysis durations on the percentage of peptides with molecular weight less than 5 000 in hydrolysate

取10 mL哈蟆油蛋白溶液（5 mg/mL）5 份，按胃蛋白酶與底物比1∶2 000加胃蛋白酶溶液，37 ℃分別酶解2、2.5、3、3.5、4 h。選取堿性蛋白酶與底物比為1∶250加堿性蛋白酶溶液，55 ℃酶解4 h，考察胃蛋白酶不同酶解時間對哈蟆油蛋白相對分子質量分布的影響。

由圖2可以看出，隨著胃蛋白酶酶解時間的延長，哈蟆油蛋白相對分子質量小于5 000所占比例的總體變化趨勢相差較小，均在90%以上，表明胃蛋白酶酶解時間對哈蟆油蛋白酶解影響較小，因此確定胃蛋白酶酶解時間為2 h。

2.1.3 堿性蛋白酶酶量的確定

取10 mL哈蟆油蛋白溶液（5 mg/mL）5 份，按胃蛋白酶與底物1∶2 000加胃蛋白酶溶液，37 ℃酶解3 h。選取堿性蛋白酶與底物比為1∶100、1∶250、1∶500、1∶1 000、1∶2 000加堿性蛋白酶溶液，55 ℃酶解4 h?？疾靿A性蛋白酶不 同酶量對哈蟆油蛋白相對分子質量分布的影響。

圖3 堿性蛋白酶不同酶量對哈蟆油蛋白相對分子質量的影響Fig.3 E ffect of different doses of alkaline protease on the percentage of peptides with molecular weight less than 5 000 in hydrolysate

如圖3所示，隨著堿性蛋白酶酶量的增加，哈蟆油蛋白相對分子質量小于5 000所占比例顯著增加，當堿性蛋白酶與底物比為1∶100時達到最大，為95.22%，表明堿性蛋白酶的用量對哈蟆油蛋白酶解影響較大，因此確定堿性蛋白酶與底物比為1∶100。

2.1.4 堿性蛋白酶酶解時間的確定

圖4 堿性蛋白酶不同酶解時間對哈蟆油蛋白相對分子質量的影響Fig.4 Effect of different alkaline protease hydrolysis durations on the percentage of peptides with molecular weight less than 5 000 in hydrolysate

取10 mL哈蟆油蛋白溶液（5 mg/mL）5 份，按胃蛋白酶與底物1∶2 000加胃蛋白酶溶液，37 ℃酶解3 h。選取堿性蛋白酶與底物比1∶250加堿性蛋白酶溶液，55 ℃分別酶解2、3、4、5、6 h，考察堿性蛋白酶不同酶解時間對哈蟆油蛋白相對分子質量分布的影響。

如圖4所示，哈蟆油蛋白相對分子質量小于5 000所占的比例隨著堿性蛋白酶酶解時間的增加呈遞增趨勢，當酶解時間達到5 h以后，哈蟆油蛋白相對分子質量小于5 000所占比例的變化較小，因此選用堿性蛋白酶酶解時間為5 h。

2.2 正交試驗結果

根據單因素試驗結果，選擇胃蛋白酶酶量（A）、胃蛋白酶酶解時間（B），堿性蛋白酶酶量（C）、堿性蛋白酶酶解時間（D）4 個因素，每個因素3 個水平，采用L9（34）正交試驗表進行試驗，以哈蟆油蛋白相對分子質量小于5 000所占比例為評價指標，對哈蟆油蛋白酶解條件進行優化。

根據單因素試驗結果，確定正交試驗的因素和水平見表1，正交試驗結果見表2，方差分析結果見表3。

表 1 正交試驗的因素水平表Table 1 Factors and levels for orthogonal array design

表 2 正交試驗設計及結果Table 2 Orthogonal array design and results

表2表明，影響哈蟆油蛋白酶解的各因素主次順序為C＞A＞D＞B；表3表明C因素（即堿性蛋白酶酶量）對哈蟆油蛋白酶解有顯著影響（P＜0.05），而A、B、D因素影響較?。≒＞0.05），因此優選出最佳工藝條件為A2B1C3D3，即胃蛋白酶與底物比為1∶2 000，胃蛋白酶酶解時間為2 h，堿性蛋白酶與底物比為1∶100，堿性蛋白酶酶解時間為6 h。

表 3 方差分析結果Table 3 Analysis of variance for the experimental results of orthogonal array design

2.3 驗證實驗

稱取2.0 g左右哈蟆油3 份，按料液比1∶100加入pH 4.5的檸檬酸200 mL，浸泡36 h，勻漿后加入4 L蒸餾水，煎煮2 h，冷卻至室溫，調節pH 2.0～3.0，按酶與底物比1∶2 000加入胃蛋白酶1.00 mg，37 ℃酶解2 h，酶解后樣品煮沸15 min，使酶失活，調節pH值至9.0～10.0，按酶與底物比1∶100加入堿性蛋白酶20.00 mg，55 ℃酶解6 h，酶解后樣品煮沸15 min，使酶失活，調pH 6.8～7.2，0.22 ?m濾膜過濾，取樣400 ?L，注入高效液相色譜儀，記錄保留時間和峰面積百分比，根據標準曲線估測哈蟆油蛋白相對分子質量大小。余下濾液凍干，取凍干粉按1.3.5節中蛋白質含量測定方法測定哈蟆油蛋白中蛋白質含量。

表 4 驗證實驗Table 4 Results of experimental verification

從表4可以看出，酶解條件為胃蛋白酶與底物比1∶2 000、酶解時間2 h、堿性蛋白酶與底物比1∶100、酶解時間6 h時，哈蟆油蛋白相對分子質量小于5 000所占的比例平均為94.85%，哈蟆油蛋白中蛋白質含量為49.85%。

3 結 論

胃蛋白酶和堿性蛋白酶雙酶法酶解哈蟆油蛋白，隨著酶解時間的延長，哈蟆油蛋白水解物的黏度呈下降趨勢[17]，這是由于哈蟆油中的黏蛋白被蛋白酶酶解成了小分子肽和低聚糖，破壞了側鏈糖基的親水性作用，使黏蛋白不能在分子周圍束縛大量的水，打破了含水微環境保護屏障[18-19]，從而降低溶液的黏度，實驗中，哈蟆油水提液只能濃縮到1 g/200 mL，而酶解液則能濃縮至1 g/25 mL，酶解液澄清度好，溶解性好，達到了良好的酶解效果，哈蟆油這種性質的改變，能夠改善哈蟆油的流動性，使加工制備哈蟆油蛋白水解物產品更易進行。同時，水解液中90%以上哈蟆油蛋白相對分子質量小于5 000，存在大量分子質量大小不等的肽段，并且含有的多肽具有多種生物活性，據相關文獻報道，哈蟆油非水溶性蛋白無耐缺氧作用，通過酶解法可以讓哈蟆油耐缺氧功效從無到有[20]，哈蟆油酶解物不僅有效的維持了哈蟆油原藥材具有的抗疲勞，降血脂功效，并且使耐缺氧和抗氧化等藥理作用進一步增強，這為哈蟆油酶解工藝的合理性及產品開發提供了理論依據。

采用胃蛋白酶和堿性蛋白酶雙酶法制備哈蟆油蛋白多肽，制備工藝穩定，哈蟆油蛋白提取率可達到80%以上，所得產品蛋白含量約為50%，產品營養價值高，既能滿足人體對多肽的需要，又能加快哈蟆油產品深加工的發展，適合大規模生產。本實驗對哈蟆油蛋白的酶解工藝進行了研究，優選出最佳酶解工藝條件為胃蛋白酶與底物比1∶2 000、胃蛋白酶酶解時間2 h、堿性蛋白酶與底物比1∶100、堿性蛋白酶酶解時間6 h，酶解得到哈蟆蛋白質相對分子質量小于5 000所占的比例可達到 94.85%，哈蟆油蛋白中蛋白質含量為49.85%。本實驗為進一步開發哈蟆油蛋白產品提供了參考依據。

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Optimization of Two-Step Enzymatic Hydrolysis of Oviductus Ranae Protein by Orthogonal Array Design

DONG Ying, ZHANG He, ZHOU Guang-xin, ZHAO Da-qing*, ZHAO Yu, CONG De-yu
(Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130117, China)

Objective: To optimize the two-step enzymatic hydrolysis of Oviductus Ranae protein. Methods: Oviductus Ranae protein was extracted by soaking in citric acid, homogenizing Oviductus Ranae and then decoting the homogenate with water, and sequentially hydrolyzed with pepsin and alkaline protease. Various hydrolysis parameters were optimized by single factor and orthogonal array design methods to obtain maximum perce ntage of peptides with molecular weight less than 5 000. Results: The optimum hydrolysis conditions were obtained as follows: pepsin hydrolysis at an enzyme/substrate ratio of 1:2 000 (m/m) for 2 h followed by alkaline protease hydrolysis at an enzyme/substrate ratio of 1:100 (m/m) for 6 h. The percentage of peptides with molecular weight less than 5 000 in the hydrolysate obtained under these conditions was as high as 94.85%, and the protein content of the hydrolysate was 49.85%. Conclusion: The combined use of pepsin and alkaline protease can effectively decompose Oviductus Ranae protein for better absorption by the body.

Oviductus Ranae protein; pepsin; alkaline protease; double enzyme method

R284.2

A

1002-6630（2014）06-0036-04

10.7506/spkx1002-6630-201406007

2013-06-21

“重大新藥創制”重大科技專項（2011ZX09401-305-09）；吉林省科技發展計劃項目 （YYZX201126）

董穎（1988—），女，碩士研究生，主要從事中藥有效成分研究。E-mail：dong571124939@163.com

*通信作者：趙大慶（1963—），男，教授，博士，主要從事中藥有效成分研究。E-mail：13843148162@163.com