甘草甜素對缺血/再灌注損傷器官的保護機制及研究進展

曲德海(綜述)，劉 冰(審校)

(哈爾濱醫科大學附屬第一醫院血管外科，哈爾濱 150001)

缺血/再灌注損傷是指缺血組織恢復血流使缺血性損傷加重的現象，是創傷、擴血管藥物治療、溶栓治療、介入治療、器官移植和休克復蘇治療后再損傷的重要病理基礎，目前研究認為其發病機制主要涉及炎性反應、氧化應激損傷、鈣超載、細胞凋亡等[1-2]。最近研究發現,高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1,HMGB1)可在組織發生缺血/再灌注時主動或者被動釋放至胞外，發揮一系列生物學效應，引起組織損傷[3]。研究發現，甘草甜素作為HMGB1抑制劑對缺血/再灌注器官具有保護作用[4-6]。

1 HMGB1的結構

HMGB1的氨基酸序列在不同物種間高度保守。HMGB1由215個氨基酸組成，相對分子質量約為30×103，其分子由2個帶正電的同源DNA結合結構域(A框和B框)和1個帶負電的富含谷氨酸及天冬氨酸的C端構成，B框與其在胞外作為炎性因子的生物活性有關[7-8]。

2 HMGB1的釋放

當機體受到損傷或刺激時，HMGB1主要通過被動分泌及主動分泌兩種途徑由核內釋放到胞外。這兩者在分子機制、釋放動力學、下游信號反應上是有區別的。被動釋放由細胞完整性的破壞引發，發生速度快[9-10]。主動分泌，由胞外產物通過與細胞質膜受體相互作用引起一系列信號轉導引發，發生速度較慢[11-12]。單核細胞、巨噬細胞、自然殺傷細胞、樹突狀細胞、內皮細胞等受微生物相關分子模式、病原相關分子模式和內源性炎性介質[包括腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、白細胞介素1(interleukin-1,IL-1)、干擾素γ]刺激后可主動分泌HMGB1。HMGB1的主動分泌并不是通過經典的高爾基體-內質網途徑進行，而是通過胞核-胞質-分泌性溶酶體-胞外途徑進行，HMGB1通過這種非經典途徑分泌是因為其缺乏引導肽結構[10]。研究表明，凋亡細胞也可釋放相當數量的HMGB1，但其釋放的HMGB1不能刺激巨噬細胞產生TNF，而壞死細胞被動釋放的HMGB1具有顯著的生物學活性。造成兩者差異的原因是凋亡細胞中線粒體內的活性氧類氧化了HMGB1結構中B框第106位的半胱氨酸[13]。在這兩條分泌途徑中，HMGB1的分子結構是有區別的，即由炎性細胞主動分泌的HMGB1是高度乙?；?，而壞死細胞被動釋放的HMGB1則不是，目前尚不清楚這一區別反映在功能上的差異性。有研究表明，巨噬細胞及中性粒細胞在釋放HMGB1之前還必須分別經過磷酸化和甲基化[14-15]。

3 HMGB1的受體及信號轉導通路

HMGB1的主要受體包括晚期糖基化終末產物受體(receptor for advanced glycation end products,RAGE)及Toll樣受體(Toll-like recept,TLR)。

3.1RAGE及其信號轉導通路 RAGE為跨膜蛋白，屬免疫球蛋白超家族成員，廣泛表達于多種細胞表面，為多配體受體[16]，與HMGB1高度親和，HMGB1通過與RAGE結合，激活絲裂原激活蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)p38、核因子κB等信號通路，可以促進免疫細胞分化、成熟和遷移，并上調細胞表面的受體水平[17-18]。抑制HMGB1與RAGE的結合可阻斷p44、p42、p38、Jun激酶、c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、MAPK和核因子κB活化，影響HMGB1發揮胞外效應[19]。在小鼠肝缺血/再灌注損傷模型中，阻斷HMGB1與RAGE結合可明顯減輕肝損傷[20]。HMGB1在心肌缺血/再灌注損傷中可通過與RAGE結合，活化炎性通路，進而導致心肌損傷[21]。

3.2Toll樣分子信號通路 TLR屬于模式識別受體家族，目前TLR家族共有13個成員，與缺血/再灌注損傷密切相關的是TLR4、TLR9。其中TLR4是HMGB1介導的巨噬細胞活化，細胞因子釋放、組織損傷的主要受體，也是目前關于HMGB1引起缺血/再灌注損傷研究中最關鍵的受體[22-23]。研究發現，TLR4基因敲除的巨噬細胞受到HMGB1刺激后不能產生TNF[24]。TLR4基因敲除小鼠肝缺血/再灌注損傷程度與野生型小鼠相比明顯減輕[25]。HMGB1與TLR4在髓樣分化蛋白2的幫助下相互結合，通過以下兩條途徑進行信號轉導。

3.2.1髓樣分化因子-依賴途徑 HMGB1結合細胞表面的TLR4受體，活化髓樣分化因子并激活其下游的信號分子，包括白細胞介素受體相關激酶1/2,MAPK p38、細胞外信號調節激酶1/2、JNK，核因子κB抑制蛋白激酶包括核因子κB抑制蛋白激酶α、核因子κB抑制蛋白激酶β等,激活核因子κB,促進相關基因轉錄及表達，產生一系列炎性因子。也有研究表明，CD24和Siglec-10能夠協同抑制HMGB1-TLR4激活核因子κB[26]。

3.2.2髓樣分化因子-非依賴途徑 TLR與配體結合后，激活包括干擾素調節因子1、轉錄活化因子1/3等在內的下游信號分子，最終活化干擾素基因，引起干擾素α及干擾素β釋放。

4 HMGB1的功能

4.1HMGB1的核內功能 核內HMGB1的主要功能是與DNA結合，穩定DNA結構，參與DNA的重組、修復、基因轉錄調控、細胞復制及分化成熟等生命活動[27]。

4.2HMGB1的胞外功能及與缺血/再灌注損傷關系 Wang等[11]于1999年發現HMGB1可由細胞核內分泌到胞外，并作為一種必須的炎性因子參與炎癥的發生與發展。近年研究表明，HMGB1在感染、自身免疫性疾病、呼吸失調、出血性休克、創傷、腦缺血損傷、動脈硬化、心肌梗死、腫瘤、缺血/再灌注損傷等病理過程中發揮重要作用[3]。與在膿毒癥中扮演的“晚期炎性介質”的角色不同，HMGB1在心臟、腎、脊髓、肝臟缺血/再灌注損傷中扮演的角色卻是“早期炎性介質”[21,28-30]。研究發現，心臟組織在缺血/再灌注損傷后HMGB1高表達，腹腔注射重組HMGB1后加重心臟組織的損傷，抗HMGB1抗體可以降低組織IL-6、TNF-α和細胞間黏附因子1的信使RNA水平，進而減輕再灌注損傷[21]。丙酮酸乙酯可以抑制HMGB1的釋放，減輕脊髓、腎缺血/再灌注損傷[28-29]。順鉑能抑制HMGB1的移位和釋放,減少TNF-α及IL-6的生成，減輕肝缺血/再灌注損傷[30]。使用HMGB1吸附柱，可以減輕小鼠肝缺血/再灌注損傷，顯著改善小鼠生存率[31]。小鼠腎臟缺血/再灌注后腎組織HMGB1表達增強，應用抗HMGB1抗體損傷明顯減輕[32]。大鼠小腸缺血/再灌注后小腸上皮細胞HMGB1表達增加，血清HMGB1水平于再灌注早期即可升高，再灌注3 h后達到峰值，抗HMGB1抗體處理后損傷減輕，48 h生存率顯著提高[33]。

5 甘草甜素與缺血/再灌注損傷

甘草甜素是豆科植物甘草根部提取物的重要成分之一，含有2分子葡萄糖醛酸和1分子甘草次酸，具有水溶性[34]。研究證實，甘草甜素具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗癌、器官保護等作用。并且甘草甜素作為HMGB1抑制劑[35]，可以減輕器官缺血/再灌注損傷。

5.1甘草甜素與下肢缺血/再灌注損傷 Nakata等[4]在兔下肢缺血/再灌注損傷模型中發現，再灌注前及再灌注1 h后靜脈注射甘草甜素可顯著減輕下肢水腫程度、降低下肢肌肉壞死率、降低肌肉中髓過氧化物酶活性，表明甘草甜素可減輕下肢缺血/再灌注程度。

5.2甘草甜素與腸道缺血/再灌注損傷 Di Paola等[5]通過阻斷腸系膜上動脈及腹腔干建立鼠腸道缺血/再灌注損傷模型發現，再灌注前5 min靜脈注射甘草甜素可以降低平均動脈壓下降程度、病死率、腸道組織髓過氧化物酶活性、腸道組織丙二醛水平、腸道組織核因子κB及轉錄活化因子3活性，減少細胞間黏附因子1表達、血漿中TNF-α及IL-1β水平，且在組織學上減輕腸道損傷。

5.3甘草甜素與肝臟缺血/再灌注損傷 Mabuchi等[6]在肝缺血/再灌注模型中于缺血前靜脈給予大、小兩種劑量(60 mg/kg,6 mg/kg)甘草甜素預處理，發現兩者均可以顯著降低血清丙氨酸氨基轉移酶水平，大劑量給予甘草甜素預處理可以顯著降低血清天冬氨酸轉氨酶水平。不同劑量的甘草甜素預處理均可以明顯改善再灌注期間肝內血流情況，大劑量的預處理可顯著改善肝小葉灌注率。通過原位末端轉移酶標記技術檢查發現不同劑量預處理均可降低肝細胞凋亡率，降低肝組織中胱天蛋白酶3活性，大劑量預處理可明顯降低血漿中HMGB1水平，通過組織學檢查發現大劑量甘草甜素預處理對肝臟具有良好的保護功能。Oqiku等[36]發現，在阻斷大鼠肝門前20 min給予甘草甜素(60 mg/kg，靜脈推注)可以抑制庫普弗細胞生成HMGB1，降低血漿HMGB1水平、肝組織中HMGB1表達及血漿天冬氨酸轉氨酶水平，從而減輕肝臟再灌注損傷。

5.4甘草甜素與脊髓缺血/再灌注損傷 Gong等[37]在脊髓缺血/再灌注模型中于缺血前30 min靜脈給予6 mg/kg甘草甜素預處理，發現血漿HMGB1水平隨再灌注時間的延長而增加，于再灌注1 h后開始升高，再灌注24 h后達到峰值，并可長時間維持在較高水平。與損傷組相比，給予甘草甜素預處理可明顯降低血漿HMGB1及炎性因子(包括TNF-α、IL-1β、IL-6)水平,并且發現兩者的水平變化高度相關。甘草甜素預處理可以降低脊髓組織中HMGB1水平、減少壞死細胞數目，可以明顯改善脊髓損傷后下肢神經功能。Ni等[38]的研究也支持以上結論，且發現再灌注組織中核因子κB、HMGB1及其受體RAGE、TLR4高表達，給予甘草甜素預處理可顯著降低核因子κB、HMGB1表達，但對于受體RAGE、TLR4的表達沒有明顯影響，說明再灌注損傷后造成受體RAGE、TLR4的高表達的機制可能是多方面的。

5.5甘草甜素與心肌缺血/再灌注損傷 Zhai等[39]在鼠心臟缺血/再灌注模型中于再灌注前給予甘草甜素10 mg/kg預處理，發現甘草甜素預處理可以減少心肌梗死范圍，降低血漿肌鈣蛋白、乳酸脫氫酶、天冬氨酸轉氨酶、HMGB1及炎性因子(TNF-α,IL-6)水平，并可通過抑制Bcl-2相關X蛋白轉移、胱天蛋白酶3活性、細胞色素C的釋放減少細胞凋亡。再灌注損傷后，JNK、MAPK p38及細胞外信號調節激酶1/2磷酸化水平均升高，說明給予甘草甜素預處理可以顯著降低JNK磷酸化水平，但并不影響MAPK p38及細胞外信號調節激酶1/2的磷酸化水平。

6 展 望

在動物缺血/再灌注損傷實驗中，甘草甜素在抗炎、抗氧化、抑制細胞凋亡等多方面對不同器官的缺血/再灌注損傷均表現出明顯的保護作用。作為HMGB1抑制劑，甘草甜素可以抑制其炎性因子作用，顯示出其在預防和治療炎癥相關疾病方面良好的應用前景?？紤]到由于物種不同，對藥物的吸收、代謝、分布、毒性反應也不同，應用于人體是否會發揮相同的作用還不清楚，所以甘草甜素能否用于臨床預防及治療缺血/再灌注損傷疾病還需要進一步的研究。

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