鴨疫里默氏菌I型整合子與耐藥基因盒檢測

蔡秀磊，單 虎

（青島農業大學動物科技學院山東省預防獸醫學重點實驗室 山東省獸藥診斷試劑工程技術研究中心，山東 青島266109）

目前，對養鴨業影響最大的細菌性傳染病之一就是鴨疫里默氏菌（Riemerella anatipestifer，RA）病[1]，該病的發病率和病死率都很高，在生產中最主要的防治手段仍然是藥物治療，但由于RA極易產生耐藥性，常有治療失敗的現象，造成很大的經濟損失，因此開展對該菌的耐藥性及耐藥基因方面的研究尤為重要。1989年，Stokes和Hall首次提出整合子(integron，In)結構[2]，該結構是一個新的可移動的基因元件，可協助耐藥基因水平傳播。此后，整合子結構作為研究細菌耐藥性的重要手段，受到了各國科研人員的關注。目前已經明確發現的整合子種類共有6種，在臨床致病菌中出現機率最多的是I型整合子。

鴨疫里默氏菌的耐藥性雖然引起了生產和科研工作的重視，但關于該菌的耐藥基因方面的研究尚未見任何報道。本研究利用PCR技術，對實驗室所保存的所有臨床分離的耐藥菌株進行了I型整合子及其捕獲的耐藥基因盒的檢測，并將所檢測到的I型整合子結構、耐藥基因序列與其他細菌做一比較，試圖分析、探討I型整合子在鴨疫里默氏菌耐藥性產生、傳播中的作用，并根據所檢測到的耐藥基因序列，初步從分子水平上分析該菌耐藥性產生的分子機制。

1 材料與方法

1.1 供試菌株 本試驗所用22株菌株分離自1999-2005年浙江省各地區鴨場出現典型漿膜炎病變的病死鴨的肝臟、心臟，經純化培養、生化鑒定、血清型鑒定、藥敏試驗之后，用于本研究。

1.2 儀器 MJPCR儀（BIO-RAD），凝膠成像系統（BIO-RAD）。

1.3主要試劑 限制性內切酶SphI、Taq DNA聚合酶、pMD18-T載體、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，均購自上海生工生物工程技術服務有限公司；1kb DNA Marker、100 bp DNAMarker，購自TaKaRa公司。

1.4 PCR法檢測I型整合子及耐藥基因盒

1.4.1 引物設計與合成 根據GenBank上發表的I型整合酶基因序列、I型整合子的5′和3′端高度保守區的基因序列，利用軟件Oligo 6.0設計特異引物。I型整合酶基因擴增引物為：intI1-F：5′-TGATGGCGA CGCACGAC-3′；intI1-R：5′-TTGGGCAGCAGCGAA GT-3′。耐藥基因盒擴增引物為：FP：5′-GGCATCC AAGCAGCAAGCGCGTTACGCCGT-3′；RP：5′-AAG CAGACTTGAC-CTGATAGTTTGGCTGTG-3′。上述引物均由北京賽百盛基因技術有限公司合成。

1.4.2 RA基因組提取 從平板上挑取純化培養的單菌落接種于LB液體培養基中，置于37℃搖床、180 r/min離心振蕩培養過夜。取上述培養液1mL置于1.5 mL離心管中，12 000 r/min（室溫）離心1min，棄上清，并加入567 uLTEBuffer（pH值8.0）重懸菌體并加入30μL10%SDS、3 uL蛋白酶K（20mg/mL），于37℃水浴中過夜。加入200 uL 3mol/LNaCl，置于65℃水浴中孵育10min。加入等體積的酚：氯仿并抽提兩次。加入1/10體積的3mol/LNaAc、2倍體積的無水乙醇，輕柔顛倒混勻，置于-20℃保持30min。用槍頭將上述液體中的絮狀沉淀勾出，并用70%乙醇洗滌沉淀1次。加入TERnase，37℃水浴內放置30min，得到的產物即可作為PCR反應的模板。

1.4.3 PCR反應體系與反應程序 建立50μLPCR反應體系：DNA Taq酶1.5 U，10×Buffer 5μL，dNTP Mixture4μL，模板5μL，上下游引物各2μL，加ddH2O至總體積50μL。

I型整合酶基因PCR反應程序為：95℃預變性5min，94℃變性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸45 s，35個循環后再72℃延伸10min結束反應。

I型整合子耐藥基因盒PCR反應程序為：95℃預變性5min，94℃變性1min，62℃退火1min，72℃延伸3min，35個循環后再72℃延伸10min結束反應。取2μL產物點樣于1.5%（1.0%）瓊脂糖凝膠電泳，用Bio-RAD成像系統觀察結果并記錄。

1.4.4 I型整合酶基因PCR擴增產物酶切鑒定 利用DNAStar-MapDraw軟件，分析intI1基因的酶切位點，對I型整合酶基因的PCR擴增產物進行酶切鑒定。

1.5 PCR產物純化、克隆、測序與序列分析 PCR產物用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行膠回收，回收產物連接到pMD18-T載體，轉化至大腸桿菌DH5α感受態，挑取轉化子并經Hind III、EcoRI雙酶切鑒定、PCR鑒定，篩選出的陽性轉化子送北京六合華大基因科技股份有限公司測序，并采用DNA?Star、BLAST對測序結果進行分析、比較。

2結果

2.1 I型整合酶檢測結果

2.1.1 PCR擴增 22株RA的I型整合酶檢測均呈陽性，檢出率為100%，產物大小約為580 bp左右，與預期結果相符。瓊脂糖凝膠電泳結果見圖1。

圖1 intI1基因PCR擴增產物

2.1.2 酶切鑒定 I型整合酶基因的PCR擴增產物經試劑盒純化后，以SphI酶切，出現約為320 bp和260 bp左右的兩條帶，產物大小與預期大小一致。瓊脂糖凝膠電泳結果見圖2。

圖2 intI1基因PCR產物Sph I酶切鑒定

2.1.3 測序結果 測序結果顯示，I型整合酶基因長度為587bp。根據GENBANK中已有的I型整合酶序列，經DNAStar軟件、BLAST軟件比對，該序列與大腸桿菌（GenBank登陸號AY522431，下同）、肺炎桿菌（AY123253）、摩爾根菌（DQ522239）、沙門菌（AY463797）的同源性均為100%。GenBank登陸號為DQ881442。

2.2 耐藥基因盒檢測結果

2.2.1 PCR擴增 22株RA的耐藥基因盒檢測均為陽性。其中，從1株RA中擴增得到大小約為1kb左右的產物，命名為In I-1，檢出率為4.5%；從21株RA中擴增得到大小約為2.4 kb左右的產物，命名為In I-2，檢出率為95.5%。瓊脂糖凝膠電泳結果見圖3。

圖3 耐藥基因盒PCR擴增產物

2.2.2 測序結果與序列分析 產物In I-1和In I-2經純化、克隆后進行測序，大小分別為1 048 bp和2 352 bp。測序結果通過DNAStar軟件與已知序列比較，并登陸GenBank，通過BLAST軟件比對。GenBank登陸號分別為EF105289、EF105290。In I-1測序結果：In I-1長度為1 048 bp，與質粒pSp14(GenBank accession no.AY139598)、質 粒pTET3(GenBank accession no.AJ420072)、質粒pLEW279a(GenBank accession no.DQ390458)中檢測到的I型整合子結構同源性達到了100%。進一步分析這一整合子序列，發現其中含有一個耐藥基因盒aadA5基因。該基因以ATG開頭、大小為789 bp，與aa?dA5基因（GenBank accession no.DQ838665）99.7%相同，編碼核苷轉移酶，導致細菌對氨基糖甙類藥物產生耐藥性。耐藥基因aadA5被整合在特異的整合位點aatI和59 be結構之間，是一種整合效率較高的整合，且其aatI、59be以及3′端保守區的序列與沙門菌(GenBank accession no.AY463797)的同源性達到了99%以上。

In I-2測序結果：InI-2長度為2 352 bp，與奇異變形菌（GenBank accession no.AY677093）中檢測到的I型整合子結構同源性為99.89%，與沙門菌（GenBank accession no.AJ746361）中檢測到的同源性為99.46%。該整合子含有3個開放閱讀框（ORF），是3個不同的耐藥基因盒。其中，長度為555 bp的ORF與aac 6-II基因（GenBank accession no.DQ402099）有99.5%相同，編碼?；D移酶，引起細菌對氨基糖甙類藥物的耐藥；長度為633 bp的ORF與cat B3基因（GenBank accession no.DQ343904）有99.7%相同，編碼氯霉素乙酰轉移酶，介導對氯霉素產生耐藥性；長度為792 bp的ORF與aadA1基因（GenBank accession no.AF313472）有99.8%相同，編碼核苷轉移酶，介導對氨基糖苷類藥物的耐藥。aac6-II、catB3、aadA1這3個耐藥基因之間分別以59 be結構為界，aac6-II基因與整合子的5′端保守區以aatI為界，aadA1基因與整合子的3′端保守區以59be為界。該整合子的5′端保守區、3′端保守區與其他細菌的同源性均達到了100%。

2.2.3 各菌株的耐藥表型與所攜帶耐藥基因盒之間的關系 在前期的研究中，我們對本試驗中所有供試菌株均開展了相關的耐藥表型研究，多重耐藥現象十分嚴重，五耐、六耐菌株所占的比例最大，均占31.8%[3]，具體見表1。菌株9攜帶了能引起對氨基糖苷類藥物耐藥的aadA5基因盒，在藥敏試驗中也表現了對丁胺卡那霉素和卡那霉素的耐藥性，耐藥表型與檢測到的耐藥基因盒吻合。但是在其他的21株菌中，均檢測到攜帶了aac6-II、catB3、aadA1這3個耐藥基因盒，而他們的耐藥表型卻不盡相同。這些菌株均表現出對氨基糖苷類藥物的耐藥性，個別菌株對青霉素、四環素、紅霉素等也有不同程度的耐受，他們雖都攜帶了介導氯霉素耐藥性的catB3基因盒，卻對氯霉素都很敏感，這可能與該基因盒距離啟動子較遠或啟動子較弱不能被正常啟動有關。

表1 22株RA的耐藥表型與攜帶耐藥基因盒情況

3 討論與結論

3.1 整合子在細菌多重耐藥迅速發展的過程中起到了重要的作用，尤其對革蘭陰性菌更為重要[4]。在臨床檢測中，I型整合子檢測陽性頻率最高。I型整合子主要由3個部分組成，分別是5′CS、可變區、3′CS，3個主要的功能元件是編碼I型整合酶的基因intI1、基因重組位點attI和啟動子[5-6]，整合子可以捕獲耐藥基因盒，并利用5′CS端的啟動子使耐藥基因盒得以表達，導致細菌耐藥性的傳播[7]。其中I型整合酶是I型整合子的標志性結構，I型整合酶檢測為陽性者，內部肯定含有I型整合子的結構，我們的檢測結果更加證實了這一理論。

3.2 我們的檢測結果顯示，I型整合子作為耐藥基因傳播的重要基因元件，在鴨疫里默氏菌中同樣存在，且在本次檢測中，陽性率達到了100%。由于I型整合子已經在大腸埃希菌、沙門菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯氏菌、不動桿菌等[8]中被檢測到并證明是引起這些細菌耐藥性產生及廣泛傳播的重要原因之一，我們可以推測I型整合子與RA的耐藥性尤其是多重耐藥性的發生與傳播有著重要的關系。本次檢測的檢出率特別高，遠高于其他報道中的59%～75%，但是與石磊等[9]自33株臨床菌株中的檢出率相同，這可能與我們自臨床上分離到的菌株的多重耐藥性比較嚴重有關。

3.3 通過對I型整合酶基因的測序結果進行分析，我們發現與其他細菌的該基因同源性達到了100%，可以認為是同一基因，故RA中的I型整合酶基因應該與其他細菌中的功能及作用機理相同或相似。這是首次在該菌中開展對I型整合酶基因的研究并證明其存在。

3.4 通過對耐藥基因盒進行擴增并測序，我們發現了aadA5、aac6-II、catB3、aadA1四種不同的耐藥基因盒，分別介導對氨基糖苷類藥物和氯霉素的耐藥，且這4個基因與在其他細菌中所檢測到的同源性均在95%以上，屬于同一基因。根據這些基因在其他細菌中引起耐藥性發生的原理，我們可以推測RA對氨基糖苷類藥物、氯霉素產生耐藥性的機理與機制與其他細菌相同，這是首次在鴨疫里默氏菌中發現耐藥基因的存在，并證明其耐藥基因與其他細菌具有很高的同源性。

3.5 分析細菌的耐藥譜和所攜帶的耐藥基因盒二者之間的關系，我們發現，細菌的耐藥表型與攜帶的耐藥基因盒沒有絕對的相關性，攜帶相同耐藥基因盒的菌株所表現出的耐藥表型并不完全相同，有的菌株雖然檢測到已經捕獲了特定的耐藥基金盒，但在臨床上并未表現對該藥的耐受，在其他相關報道中也發現類似結果[10]。這提示我們整合子結構并不是引起細菌多重耐藥的惟一原因，還與其他耐藥機制有關。而且耐藥基因盒的表達強弱也是受多種條件因素控制的，比如啟動子的強弱、耐藥基因盒與啟動子之間的距離等。

通過對鴨疫里默氏菌I型整合子結構的研究，對其中所捕獲的耐藥基因盒的解析，我們可以根據這些耐藥基因序列建立快速的細菌耐藥基因盒的檢測方法，并為我們研究該菌耐藥性的產生機制、傳播途徑、臨床上及時監測該菌的藥物敏感性提供一個新途徑。整合子結構是細菌耐藥性傳播的重要機制，耐藥基因可以通過該結構在不同的細菌、地區之間進行傳播，所以開展細菌整合子的監測工作可以有效的指導臨床用藥并控制耐藥細菌的傳播。

[1] Seger P，Mannheim W，VancanneytM，etal.Riemerella anatipest?ier gennov，combnov，the causitive agentofsepticemia anserum ex?sudativa and itsphylogenetic affiliationwithin the Flavobacterium-Cy top haga rRNA homology group[J].International Journal of Sys?tematic Bacteriology，1993，43（4）：768-776.

[2]Stokes H W，Hall R M.A novel family of potentially mobile DNA elements encoding site-specific gene-integration functions inte?grons[J].MolMicrobiol，1989，3（12）：1669-1683.

[3]蔡秀磊，韋強，崔言順，等.浙江省22株鴨疫里默氏桿菌的血清型鑒定及耐藥性研究[J].浙江農業學報，2007，19（1）：46-49.

[4]Rowe-Magnus D A，Guerout A M，Mazel D.Bacterial resistance evolution by recmitment of super-integron gene cassettes[J].Mo?lecularMicrobiology，2002，43（6）：1657-1669.

[5]Hall RM，Stokes H W.Integrons novel DNA elementswhich cap?ture genes by site-specific recombination[J].Genetica，1993，90（2-3）：115-132.

[6] GoldStein C，Lee M D，SANCHEZ S.Incidence of class 1 and 2 integrases in clinical and commensal bacteria from livestock，com?panion animals，and exotics[J].Antimicro Agents Chemother，2001，45（3）：723-726.

[7]Brown H J，Stokes H W，Hall R M.The integron In0,In2,and In5 are defective transposon derivatives[J].JBacteriol，1996，178(15)：4429-4437.

[8]Flu it A C，Schmitz F J.Resistance integrons and super-integrons[J].Clin Microbiol Infect，2004，10（4）：272-288.

[9]石磊，臨床致病菌整合子檢測及耐藥基因盒序列分析[J].中華醫學檢驗雜志，2005，28（11）：1204-1210.

[10]Lee M D，Sanchez S，Zimmer M，et al.Class 1 integron associated tobramycin-gentamicin resistance in Campylobaeter jejuni isolated from the broiler chickenhouse environment[J].Antimicrob Agents Chemother，2002，46（11）：3660-3664.