絞股藍皂苷對人衰老皮膚成纖維細胞抗氧化酶活性的影響

叢 敬 郭 麗丁曉慧 吳景東 宮 倩

1.沈陽醫學院組胚教研室，遼寧沈陽110034；2.沈陽醫學院中心實驗室，遼寧沈陽110034；3.遼寧中醫藥大學學生處，遼寧沈陽110031；4.沈陽醫學院基礎醫學院，遼寧沈陽110034

絞股藍皂苷對人衰老皮膚成纖維細胞抗氧化酶活性的影響

叢 敬1郭 麗2丁曉慧1吳景東3宮 倩4

1.沈陽醫學院組胚教研室，遼寧沈陽110034；2.沈陽醫學院中心實驗室，遼寧沈陽110034；3.遼寧中醫藥大學學生處，遼寧沈陽110031；4.沈陽醫學院基礎醫學院，遼寧沈陽110034

目的在細胞水平研究絞股藍皂苷對抗氧化酶活性的影響。方法原代培養并建立人衰老皮膚成纖維細胞系，0、5、10、15 mg/L絞股藍皂苷處理細胞，24、72、96 h后，四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法檢測細胞增殖；72 h后檢測超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性。結果藥物作用24、72 h后，10、15mg/L絞股藍皂苷可以促進人衰老成纖維細胞增殖，增殖效應呈時間和濃度依賴（P＜0.05）。與0 mg/L比較，10、15 mg/L絞股藍皂苷可以增強細胞SOD、CAT、GSH-Px活性（P＜0.05），且與10mg/L絞股藍皂苷比較，15 mg/L絞股藍皂苷能夠顯著提高SOD和GSH-Px活性（P＜0.05）。結論絞股藍皂苷可以通過提高SOD、CAT、GSH-Px活性，削弱氧化應激反應對細胞的損傷，使細胞增殖能力增強，延緩細胞衰老。

絞股藍皂苷；成纖維細胞；超氧化物歧化酶；過氧化氫酶；谷胱甘肽過氧化物酶；衰老皮膚

衰老是一種多環節的生物學過程，是機體在退化時期功能下降和紊亂的綜合表現，是體內各臟器細胞功能減低的現象[1]。成纖維細胞對于膠原蛋白Ⅰ和Ⅲ的合成下降是皮膚衰老的重要特征[2]。絞股藍是葫蘆科草質藤本植物，是五加科之外唯一含有與人參皂苷相似結構皂苷的植物，其皂苷成分具有保護心腦血管、抗腦缺氧、抗腫瘤及抗衰老等藥理作用，并在治療高血脂癥、血管性癡呆、消化道潰瘍以及中風等方面取得了一定的療效，因此引起國內外眾多學者的重視[3]。本實驗研究絞股藍皂苷對于人衰老皮膚成纖維細胞多種抗氧化酶活性的影響，淺探其在細胞水平的抗衰老作用和機制，為絞股藍的進一步臨床應用及市場開發提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

皮膚標本3例，取自施行眼袋切除術和倒睫矯正術的老年女性眼瞼周圍的正常皮膚，年齡55～60歲，由中國醫科大學第四附屬醫院眼科提供。絞股藍皂苷，成都曼思特生物科技有限公司；DMEM培養基、胎牛血清，美國GIBCO公司；胰蛋白酶，美國Sigma公司；磷酸鹽緩沖液，中國北京中杉金橋生物技術有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒，南京建成生物醫學工程研究所；其他試劑為國產分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 建立細胞系及分組皮膚標本用膠原酶消化，置37℃，5%CO2培養箱中植塊法原代培養，建立衰老的人皮膚成纖維細胞系。實驗選用第3～6代細胞，分為0、5、10、15mg/L絞股藍皂苷組，即A、B、C、D組，給予對應濃度的絞股藍皂苷處理細胞，24、72、96 h后，四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法檢測細胞增殖情況；72 h后，檢測SOD、CAT、GSH-Px活性。

1.2.2 制備絞股藍皂苷取0.1 g絞股藍皂苷溶于1mL二甲基亞砜（DMSO），配成0.1mg/L的貯存液，DMEM培養液倍比稀釋，使其終濃度分別為5、10、15mg/L。1.2.3 MTT法檢測細胞增殖制備單細胞懸液，接種于96孔板上，分別加入絞股藍皂苷0、5、10、15μg/mL，同時根據DMSO的濃度做相應溶劑對照，每組細胞的藥物濃度孔及相應溶劑對照孔均做5復孔。另做1孔不加細胞，只加培養液和絞股藍皂苷。共做3塊培養板。培養24、72、96 h各取出1塊培養板，MTT法檢測各孔吸光度值[4]。

1.2.4 細胞抗氧化酶活性測定分別收集各組細胞，超聲破碎，離心取上清液，按試劑盒說明書中的方法測定SOD、CAT、GSH-Px活性。

1.3 統計學方法

采用SPSS 13.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，方差齊時，行單因素方差分析，LSD-t法進行多組間兩兩比較；方差不齊時，采用非參數分析進行多組間比較，Dunnett T3法進行多組間兩兩比較[5]。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 絞股藍皂苷濃度和作用時間對衰老成纖維細胞增殖的影響

加入不同濃度絞股藍皂苷，培養24、72、96 h可見，各組細胞均繼續生長，其中24 h及72 h細胞生長較快，至96 h細胞生長放緩。培養24、72 h時，與A組比較，B組無促進細胞增殖作用，C組、D組表現為增殖促進（P＜0.05），且D組的增殖促進作用更強（P＜0.05）。培養96 h時，呈飽和狀態，藥物濃度對細胞增殖作用組間差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 絞股藍皂苷濃度和作用時間對衰老成纖維細胞增殖的影響

2.2 濃度對衰老成纖維細胞抗氧化酶活性的影響

SOD活性檢測結果顯示，與A組比較，B組差異無統計學意義（P＞0.05）；C組、D組細胞SOD活性提升（P＜0.05），且D組作用更強（P＜0.05）。CAT活性檢測結果顯示，與A組比較，B組差異無統計學意義（P＞0.05）；C組、D組細胞CAT活性增強（P＜0.05）。GSH-Px活性檢測結果顯示，與A組比較，B組差異無統計學意義（P＞0.05）；C組、D組細胞GSH-Px活性均有不同程度增強（P＜0.05），且D組增強更顯著（P＜0.05）。提示絞股藍皂苷可提高人衰老皮膚成纖維細胞SOD、CAT、GSH-Px活性，且呈濃度依賴。見表1。

表1 濃度對衰老成纖維細胞抗氧化酶活性的影響（kU/L，s）

表1 濃度對衰老成纖維細胞抗氧化酶活性的影響（kU/L，s）

注：與A組比較，△P＜0.05；與C組比較，#P＜0.05；SOD：超氧化物歧化酶；CAT：過氧化氫酶；GSH-Px：谷胱甘肽過氧化物酶

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3 討論

衰老的自由基學說認為皮膚細胞的內源性衰老和外源性衰老有著共同的分子機制，即均遭受活性氧（ROS）所致的氧化應激，并引發一系列后續效應。ROS不僅能直接損害線粒體導致能量產生不足和鈣平衡紊亂，還能直接損傷細胞膜脂質、核酸、酶和受體等生物大分子，導致生物膜脂質過氧化、基因穩態失衡或基因突變，蛋白質羥基化、酶失活；與此同時，清除自由基的抗氧化酶的活性不斷下降使體內的自由基物質過剩，最終導致衰老[6-7]。生物體內具有多種抗氧化酶體系。SOD具有清除超氧陰離子、減輕過氧化損害、保護細胞免受自由基傷害的作用[8]。CAT可以利用H2O2氧化各種底物，使有毒物質失活，同時催化H2O2分解為H2O與O2，是生物防御系統的關鍵酶之一[9]。GSH-Px是一種重要的過氧化物分解酶，它能催化谷胱甘肽變為氧化型谷胱甘肽，清除在細胞呼吸代謝過程中產生的過氧化物和羥自由基，使有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物，從而保護細胞膜的結構及功能不受過氧化物的干擾及損害。在正常情況下，機體代謝過程中產生的超氧陰離子被細胞的SOD歧化為H2O2，后者再由CAT和GSH-Px催化降解[10]。

成纖維細胞合成分泌的纖維蛋白參與構成了真皮層中細胞成分之外的所有組分。皮膚衰老的種種臨床表現都與成纖維細胞數量減少、合成功能下降或異常有關。有研究顯示，成纖維細胞從“年輕”向“老化”發展的進程中，伴隨著DNA和蛋白質的氧化損傷，細胞氧化還原狀態的改變，細胞內ROS水平逐漸增高[11]，抗氧化酶活性降低[12]。動物實驗[13-14]表明，灌胃（0.8 m L/t）配以外用（5 g/t）絞股藍提取液可以增強自然衰老小鼠皮膚組織內SOD、CAT的活性。絞股藍皂苷是絞股藍中提取出來的藥效成分。外用1.5%絞股藍皂苷霜可使光損傷模型小鼠表皮中抗氧化酶活性得到恢復，其抗氧化作用與維生素E霜相似[15]。本文研究結果進一步證實，絞股藍皂苷可以在細胞水平提高抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px活性，拮抗ROS對成纖維細胞數量和功能的損傷，促進成纖維細胞增殖，修復甚至提高其合成分泌功能，從而使改善皮膚衰老成為可能，但其具體的分子機制尚需進一步證實。關于人衰老皮膚成纖維細胞的相關研究可以為闡明皮膚衰老的機制，探尋細胞衰老與器官衰老之間的關系提供佐證。

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Effect of gypenosides on antioxidative enzymes of human aged skin fibroblasts

CONG Jing1GUO Li2DING Xiaohui1WU Jingdong3GONG Qian4
1.Department of Histology and Embryology,Shenyang Medical College,Liaoning Province,Shenyang 110034,China; 2.Central Lab,Shenyang Medical College,Liaoning Province,Shenyang 110034,China;3.Students Affair Office, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Liaoning Province,Shenyang 110031,China;4.School of Basic Medicine,Shenyang Medical College,Liaoning Province,Shenyang 110034,China

Objective To study the effect of gypenosides(Gyp)on the activity of antioxidative enzymes at cellular level. Methods After the primary culture and subculture,human aged skin fibroblastswere incubated with Gyp(0,5,10,15 mg/L)for 24,72 and 96 h respectively.The MTTmethod was used to evaluate the cell proliferation and assay the biologic activities of Gyp in different time and different doses.Relative level of the activity of SOD,CAT and GSH-Px in cellsweremeasured by cytochemistry.Results Aged fibroblasts proliferation could be promoted by Gyp(10,15 mg/L) for 24,72 hours treatment(P＜0.05).The activity of SOD,CAT and GSH-Px increased in both group 10 and 15mg/L Gyp as compared with group 0mg/L(P＜0.05).Compared with 10mg/LGyp group,15 mg/LGyp group showed significantly increased in the activity of SOD and GSH-Px(P＜0.05).Conclusion Gyp protects the aged fibroblasts by weakening oxidative stress,increasing the activity of antioxidative enzymes,and therefore delay the cells ageing.

Gypenosides;Fibroblasts;SOD;CAT;GSH-Px;Aged skin

R-332

A

1673-7210（2014）01（b）-0032-03

2013-11-13本文編輯：程銘）