氮磷比對不同生長時期強壯前溝藻富集2,2’,4,4’-四溴聯苯醚的影響

葛 蔚柴 超尹遜棟昌 晶

(1. 青島農業大學生命科學學院, 青島 266109; 2. 青島農業大學資源與環境學院, 青島 266109)

氮磷比對不同生長時期強壯前溝藻富集2,2’,4,4’-四溴聯苯醚的影響

葛 蔚1柴 超2尹遜棟2昌 晶2

(1. 青島農業大學生命科學學院, 青島 266109; 2. 青島農業大學資源與環境學院, 青島 266109)

以海洋微藻強壯前溝藻(Amphidinium carterae Hulburt)為研究對象, 研究氮磷比對強壯前溝藻不同生長時期富集2,2’,4,4’–四溴聯苯醚(BDE-47)的影響, 測定其比生長率、脂類和碳水化合物等指標, 分析了不同生長時期強壯前溝藻對BDE-47的富集與其生長和生化成分的關系。研究發現, 在強壯前溝藻的適應期, 氮磷比16時的強壯前溝藻細胞富集量為1.3 ng/(106cells), 顯著低于其他氮磷比; 在對數期和穩定期, 氮磷比64、128時其富集量顯著高于其他氮磷比, 對數期氮磷比64和128的富集量可達2.5—2.6 ng/(106cells), 約是其他氮磷比的1.5倍; 穩定期時約是其他氮磷比的2.4倍, 且氮磷比128時高達3.6 ng/(106cells)。不同氮磷比下強壯前溝藻對 BDE-47的富集量與脂類含量之間呈一定的正相關關系, 線性擬合回歸系數近0.6。結果表明, 營養鹽結構導致了強壯前溝藻的生長和脂類等生化成分變化, 并與 BDE-47富集量呈正相關關系,從而可對強壯前溝藻富集BDE-47產生影響。

氮磷比; 多溴聯苯醚; 富集; 微藻

阻燃劑是一類能阻止塑料等高分子材料被引燃的功能性助劑, 在過去的30年中, 其使用量持續增加, 目前全球產量高達每年31萬噸[1]。其中, 多溴聯苯醚(PBDEs)是一類使用最廣泛的阻燃劑, 大量應用于塑料、電子電器、建材、紡織品、家具等產品中[2]。作為一種添加型阻燃劑, PBDEs僅是混入塑料等產品中, 并不形成化學鍵, 這導致PBDEs極易從產品中流出而進入環境[3]。自20世紀70年代在環境中首次發現PBDEs后, PBDEs在環境和生物樣本中的含量呈指數增長趨勢, 目前已成為全球性污染物[4,5]。PBDEs具有較強的毒性、持久性和生物累積性, 因此關于它對環境和生物所造成的影響已成為環境科學的熱點問題[6]。

近年, 海洋環境面臨著PBDEs污染, ?世界范圍的近海水體中均檢測到了PBDEs。在我國, 廈門近海沉積物中8種PBDEs的平均含量為16.31 ng/g, 間隙水中平均濃度為15.3 ng/L[7]; 珠江口海水中17種 PBDEs的濃度范圍為0.34—68.0 ng/L[8]; 長江口表層沉積物中12種PBDEs的最高濃度為0.55 ng/g[9]。調查發現, 在209種PBDEs同系物中, 2,2’,4,4’-四溴聯苯醚(BDE-47)是一種主要存在于中國近海水體和水產品的一種PBDEs同系物[10—12]。

海水中的有機污染物能夠被微藻富集并在食物鏈中傳遞[13], 而海水中的營養鹽影響著微藻對有機物的富集程度。在營養匱乏環境中的淡水微藻對多氯聯苯和多氯代二苯并呋喃的富集量更高[14,15], 同時營養鹽濃度影響了海洋微藻對PBDEs的富集[16, 17]。上述研究主要是針對營養鹽濃度, 關于營養鹽結構對海洋微藻富集有機物的影響研究未見報道。本研究以我國近海常見的海洋微藻——強壯前溝藻(Amphidinium carterae Hulburt)為實驗材料, 以近海環境和生物中主要存在的BDE-47為PBDEs的代表, 研究氮磷比對強壯前溝藻富集PBDEs的影響, 為探索不同營養條件下海洋微藻對有機污染物的富集特征提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 微藻培養條件

強壯前溝藻來自于中國科學院海洋研究所生態室, 于光照培養箱中采用F/2培養基單種培養, 培養溫度(20±1)℃ , 光照4000 lx, 光暗比為12h︰12h。

1.2 氮磷比設置

強壯前溝藻在無氮、磷人工海水中培養48h后,接種于 5 L無菌人工海水中, 添加硝酸鹽( NO3-)和磷酸鹽( PO4

3-), 氮磷比分別設置為: 1 ( NO3-: 16 μmol/L, PO4

3-: 16 μmol/L)、4 ( NO3-: 64 μmol/L, PO4

3-: 16 μmol/L)、16 ( NO3-: 256 μmol/L, PO43-: 16 μmol/L)、64 ( NO3-: 256 μmol/L, PO43-: 4 μmol/L)、128 ( NO3-: 256 μmol/L, PO43-: 2 μmol/L)。微量元素和維生素濃度根據F/2培養基加入。

在接種后的第 1天(適應期)、第 4天(對數期)和第9天(穩定期), 從培養體系中取出600 mL藻液,根據文獻[13], 加入 0.6 mL BDE-47的甲醇工作液(濃度為0.2 μg/mL), 使最終BDE-47濃度為0.2 μg/L。強壯前溝藻在 0.2 μg/LBDE-47環境中暴露24h后,收集藻細胞, 測定微藻生化組分和 BDE-47的富集量等。實驗重復三次。

1.3 測定方法

細胞計數 培養開始后每 24h后取一定體積藻液, 加入魯哥試劑, 用血球計數板計數測定藻細胞密度。

營養鹽的測定 培養開始后每24h后用0.45 μm微孔濾膜過濾一定量藻液, 濾液分別用鎘柱還原法[18]和抗壞血酸還原的磷鉬蘭法[19]測定硝酸鹽和磷酸鹽含量。

碳水化合物和總脂的測定 過濾收集強壯前溝藻細胞, 根據 Zhao等的方法[20]預處理碳水化合物和總脂樣品, 并分別采用苯酚–硫酸法和重鉻酸鹽氧化法[20]。

BDE-47的測定 強壯前溝藻暴露于BDE-47環境24h后, 取一定體積藻液過濾, BDE-47提取、純化和測定方法見Chai等[17]。BDE-47的測定設置了實驗空白和雙平行樣, 并采用 2,2’,4,4’,5,5’-六溴聯苯醚(BDE-153)做回收率指示劑, 平均回收率為(84±10)%, 數據未采用回收率校正。

1.4 數據處理方法

采用SPSS 16.0軟件對結果進行方差檢驗。

2 結果

2.1 營養鹽在培養過程中的變化

在不同氮磷比條件下, 硝酸鹽和磷酸鹽濃度均呈降低趨勢(圖1、圖2)。氮磷比為1時, 硝酸鹽濃度在第8天濃度降低到0.2 μmol/L, 在培養第10天未檢出; 其余氮磷比條件下的硝酸鹽濃度在培養最后1天的濃度為(4.80—159.50) μmol/L (圖1)。根據Justic等[21]提出的浮游微藻生長所需最低氮濃度為 1 μmol/L的標準, 氮磷比為1時, 培養體系在第9天呈現氮限制特征, 其他氮磷比條件未出現氮限制特征。

磷酸鹽的變化表明, 培養至第 5天時氮磷比128中的磷酸鹽濃度降低到0.04 μmol/L, 在第6至第10天未檢出; 氮磷比64條件下的磷酸鹽濃度在培養第 9天時為 0.30 μmol/L, 在最后 1天未檢出;氮磷比16時, 在培養第9天的濃度為0.95 μmol/L,到最后1天降低到0.04 μmol/L; 而在其他氮磷比條件下的磷酸鹽在第10天的濃度為(0.39—0.75) μmol/L。根據微藻生長的磷營養鹽閾值為0.1 μmol/L的標準[21],在氮磷比為128條件下強壯前溝藻生長在第6至第10天一直受到磷限制, 而氮磷比為64在最后1天出現了磷限制特征, 氮磷比為 16時雖然在培養最后的濃度為 0.04 μmol/L, 但在第 9天時的濃度仍為0.95 μmol/L, 因此可能未受到明顯的磷限制。

2.2 不同氮磷比下強壯前溝藻的密度和比生長率

培養第1天強壯前溝藻密度沒有顯著差異(圖3),約為2.0×104cells/mL。第2至第6天微藻進入對數生長期, 氮磷比1、4、16條件下的細胞密度高于64、128條件下約0.5倍。第9至第10天微藻基本進入穩定期, 各氮磷比下的細胞密度均出現顯著差異,氮磷比為16時的密度高達14.0×104cells/mL, 氮磷比為128是的密度最低, 僅為6.8×104cells/mL。

圖1 不同氮磷比條件下培養過程中硝酸鹽的濃度變化Fig. 1 The change of nitrate concentration under different N/P ratios during cultivation

圖2 不同氮磷比條件下培養過程中磷酸鹽的濃度變化Fig. 2 The change of phosphate concentration under different N/P ratios during cultivation

在不同氮磷比下強壯前溝藻的比生長率也出現一定的差異(圖 4), 其中氮磷比為 16時的平均和最大比生長率均最高, 分別為 0.20和 0.49/d; 其次是在氮磷比為1和4條件下, 平均比生長率為(0.17—0.18)/d, 最大比生長率為0.36/d; 比生長率最低的氮磷比條件為 64和 128, 平均比生長率為(0.11—0.13)/d, 最大比生長率為(0.26—0.30)/d。因此, 強壯前溝藻的生長在最適氮磷比 16時的密度和比生長率最高, 在低氮磷比條件下略低, 在高氮磷比條件下最低。

2.3 不同氮磷比下強壯前溝藻的脂類和碳水化合物含量

圖3 不同氮磷比條件下強壯前溝藻的細胞密度Fig. 3 The cell density of Amphidinium carterae Hulburt under different N/P ratios during cultivation

不同氮磷比條件下強壯前溝藻細胞脂類含量見圖 5, 在強壯前溝藻生長的適應期, 細胞內脂類含量范圍在 7.8—9.8 mg/(108cells), 其中氮磷比為 16時的脂類含量最低, 但總體上沒有出現顯著差異(P＞0.05); 對數期氮磷比128時的脂類含量為12.9 mg/ (108cells), 顯著高于其他氮磷比; 穩定期氮磷比 64和128的脂類含量分別為11.2和13.1 mg/(108cells), 而氮磷比1、4和16時為7.8—8.8 mg/(108cells), 在高氮磷比的脂類含量顯著升高(P＜0.05)。與脂類相似,適應期細胞內碳水化合物沒有顯著差異(圖6), 范圍為0.7—0.8 mg/(108cells); 在對數期和穩定期, 氮磷比64和128時的碳水化合物含量分別為1.4—1.5 mg/ (108cells)和1.5—1.8 mg/(108cells), 顯著高于其他氮磷比 (P＜0.05)。 總體上, 在各氮磷比下適應期強壯前溝藻的脂類和碳水化合物含量無顯著差異; 在對數期和穩定期, 高氮磷比時的兩種生化成分含量顯著升高。

圖 4 不同氮磷比條件下強壯前溝藻的平均比生長率和最大比生長率Fig. 4 The average and maximum specific growth rate of Amphidinium carterae Hulburt under different N/P ratios during cultivation

圖5 不同氮磷比條件下強壯前溝藻細胞脂類含量Fig. 5 Cellular lipid of Amphidinium carterae Hulburt under different N/P ratios

2.4 不同氮磷比下強壯前溝藻對BDE-47的富集量

不同氮磷比下強壯前溝藻對 BDE-47的富集量見圖 7, 適應期氮磷比為 16時的細胞富集量為1.3 ng/(106cells), 顯著低于其他氮磷比(P＜0.05);對數期時, 氮磷比64和128的富集量分別為2.5和2.6 ng/(106cells), 在其他條件下為 1.5—1.8 ng/ (106cells),在高氮磷比條件下強壯前溝藻對 BDE-47的富集量顯著升高 (P＜0.05); 與對數期相似, 穩定期的富集量也是在氮磷比64、128時顯著高于其他氮磷比(P＜0.05), 約是其他條件下的 2.4倍, 其中氮磷比128時的富集量最高, 為3.6 ng/(106cells)。

圖6 不同氮磷比條件下強壯前溝藻細胞碳水化合物含量Fig. 6 Cellular carbohydrate of Amphidinium carterae Hulburt under different N/P ratios

圖7 不同氮磷比條件下強壯前溝藻細胞對BDE-47的富集量Fig. 7 The bioaccumulated BDE-47 amount in Amphidinium carterae Hulburt under different N/P ratios

在不同氮磷比下強壯前溝藻對 BDE-47的富集量與脂類和碳水化合物含量之間呈一定的正相關關系(圖8), 隨著生化成分含量的增加, BDE-47富集量呈上升趨勢。與碳水化合物相比, 強壯前溝藻對BDE-47的富集量與脂類的正相關關系更良好, 線性擬合回歸系數接近0.6。

3 討論

3.1 營養鹽結構對微藻細胞富集有機污染物的影響

Lynn等[13]報道, 在低磷、低硅環境中培養的硅藻極小冠盤藻 Stephanodiscus minutulus細胞對2,2’,6,6’-四氯聯苯的富集量分別是高磷、硅環境中的1.7和2.6倍, 同時發現在低氮環境下富集量也高于高營養環境, 但差異較小。Datta[15]在硅藻梅尼小環藻Cyclotella meneghiniana對2,2’,4,4’,5,5’-六氯聯苯的富集研究中發現了相似的規律, 即細胞富集量在低硅環境中＞低磷＞低氮＞高營養。但 Kilham[14]對硅藻固定化菱形藻 Nitzschia sp.富集氘代的多氯代二苯并呋喃時發現富集量在低硅環境中＞高營養＞低磷, 規律略有不同, 這可能是由于研究采用的微藻和有機物種類均不同。葛蔚等[16]研究了不同氮濃度下硅藻牟氏角毛藻Chaetoceros muelleri對2,2’,4,4’, 5-五溴聯苯醚的富集量, 發現隨著氮濃度的升高,細胞富集量呈降低趨勢。Chai等[17]發現, 在缺氮、缺磷環境中, 甲藻東海原甲藻 Prorocentrum donghaiense對三種多溴聯苯醚同系物的富集量均顯著高于高氮、磷環境。因此, 當營養鹽限制或匱乏時,微藻對有機物的富集量可能升高。本研究也發現了相似的規律, 由于初始氮磷比的差異, 培養過程中氮、磷濃度發生了變化(圖1、圖2), 導致氮磷比64時強壯前溝藻的生長在穩定期受到了磷的限制, 氮磷比128時在對數期和穩定期均受到嚴重的磷限制,使得強壯前溝藻在對數期和穩定期時對多溴聯苯醚的富集量顯著升高(圖7); 同時氮磷比為1時微藻的生長在穩定期受到了氮限制(圖1), 使得對多溴聯苯醚的富集量也略高于氮磷比為4和16時, 但差異不明顯(圖7)。

圖8 強壯前溝藻細胞BDE-47的富集量與生化成分的關系Fig. 8 Relationship of bioaccumulated BDE-47 amount and biochemical composition content in Amphidinium carterae Hulburt under different N/P ratios

3.2 營養鹽結構對微藻細胞生長和生化成分的影響

Redfield等曾提出微藻生長的最適氮磷比為16,當氮磷比低于 16時氮可能是微藻生長的限制性營養鹽, 高于16時則磷可能是限制性因素[22]。但由于微藻對氮、磷的吸收率存在差異, 不同微藻生長的最適氮磷比也不同。研究發現, 東海原甲藻、球形棕囊藻和尖刺擬菱形藻的最適氮磷比分別為30、30和 10[23], 而新月柱鞘藻、青島大扁藻和米氏凱倫藻分別在氮磷比160、4和80時細胞比生長速率最快[24]。在本研究中, 氮磷比為16時, 強壯前溝藻生長的種群密度最大, 其次是在低氮磷比時, 而在高氮磷比下種群密度顯著降低(圖 3); 與密度相似, 強壯前溝藻的最大和平均比生長率均是在氮磷比為 16時最高, 在氮磷比為64 和128等高氮磷比下較低。

氮磷比除影響微藻的種群密度和比生長率外,還影響了其脂類和碳水化合物等生化成分的含量。研究發現, 東海原甲藻Prorocentrum donghaiense在低氮磷比時的總脂和總碳水化合物含量是氮磷比16時的 2倍[20], 同時, 高氮磷比也會導致綠色巴夫藻Pavlova viridis脂類和碳水化合物的增加[25]; 也有研究發現, 雖然硅藻 Bacillariophyceae和普林藻Prymnesiophyceae在磷限制環境中脂類含量增加了,但綠色鞭毛藻N. atomus 和Tetraselmis sp.卻降低了[26], 這可能是由于微藻生化成分對氮磷比的響應存在種間差異。在本研究中強壯前溝藻在適應期不同氮磷比下脂類和碳水化合物含量沒有出現顯著差異, 但在對數期和穩定期, 高氮磷比條件下其含量均顯著升高, 而低氮磷比時的變化不明顯(圖3)。由于脂類和碳水化合物是微藻作為能量用來儲存的,當環境中的營養鹽匱乏或限制時, 其含量可能會升高, 以使微藻渡過惡劣環境[27]。在本研究中, 盡管氮磷比為 1時在穩定期微藻受到一定的氮限制, 但生化成分的變化不明顯; 但在氮磷比為64和128等高氮磷比條件下, 在對數期和穩定期微藻受到磷限制, 導致其脂類和碳水化合物顯著升高, 這可能是由于與氮限制相比, 強壯前溝藻的生長和生化成分含量對磷限制更為敏感。

3.3 微藻對有機污染物的富集與其生長和生化成分的關系

生物富集有機污染物的主要機制是有機化合物在生物的脂類物質中和水中的分配。研究發現, 多環芳烴、二氯聯苯、有機氯等有機污染物通常富集在脂類含量豐富的水生生物中, 在同一生物中則脂類含量高的生物組織中富集因子較高[28—30]。本研究也發現, 微藻富集的 BDE-47與其脂類含量呈一定的正相關關系(圖8)。營養鹽結構導致了強壯前溝藻細胞中脂類的變化, 而脂類與微藻富集的有機物呈正相關關系, 因此, 營養鹽結構最終導致其對BDE-47富集量的改變。此外, 微藻對有機物的富集還與其生長有關。研究發現, 當微藻的生長速率超過對有機物的吸收速率時, 微藻細胞內的有機物含量降低, 即生長稀釋作用[31]。在本研究中, 當氮磷比為16時, 強壯前溝藻的最大和平均比生長率均最高(圖 4), 這可能也是導致該氮磷比條件下的 BDE-47含量較低的原因。

4 結論

氮磷比對不同生長時期的強壯前溝藻富集多溴聯苯醚具有影響, 在強壯前溝藻的適應期, 氮磷比16時的強壯前溝藻細胞對 BDE-47的富集量最低,為1.3 ng/(106cells); 在對數期和穩定期, 氮磷比64和 128的富集量顯著高于其他氮磷比, 分別是其他氮磷比的1.5和2.4倍, 其中穩定期氮磷比128時的富集量高達3.6 ng/(106cells)。不同氮磷比下強壯前溝藻對 BDE-47的富集量與其生化成分含量之間呈一定的正相關關系, 其中與脂類含量的相關性較高,線性擬合回歸系數近0.6。營養鹽結構導致了強壯前溝藻的生長和脂類等生化成分變化, 而生化成分含量與BDE-47富集量呈正相關關系, 因此, 營養鹽結構導致強壯前溝藻BDE-47富集量的改變。

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EFFECTS OF N/P RATIOS ON BIOACCUMULATION OF 2,2’,4, 4’–TETRABROMODIPHENYL ETHER BY AMPHIDINIUM CARTERAE HULBURT IN DIFFERENT GROWTH PHASES

GE Wei1, CHAI Chao2, YIN Xun-Dong2and CHANG Jing2
(1. College of Life Science, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China; 2. College of Resource and Environment, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China)

In this study we explored the bioaccumulation of 2,2’,4,4’–Tetrabromodiphenyl ether (BDE-47) by Amphidinium carterae Hulburt under different N/P ratios (1, 4, 16, 64, 128) in different growth phases. Specifically we examined the algal specific growth rate and the biochemical composition including lipid and carbohydrate, as well as the relationship between the amount of bioaccumulated BDE-47 and the biochemical composition. The results showed that the amount of bioaccumulated BDE-47 was 1.3 ng/(106 cells) when the N/P ratio was 16 in the lag phase which was significantly lower than those under other N/P ratios. In the log and stationary phase, the bioaccumulated BDE-47 under N/P ratios of 64 and 128 was significantly richer than those under other ratios. Under the two N/P ratios mentioned above, the amounts of bioaccumulated BDE-47 in the log [2.5—2.6 ng/(106 cells)] and stationary phases were 1.5 and 2.4 times higher than those under other N/P ratios respectively. It reached to 3.6 ng/(106 cells) under N/P ratio of 128 in stationary phases. There was a positive correlation between the amount of bioaccumulated BDE-47 and cellular lipid, with the R2 value of nearly 0.6. Our results showed that the lipid content was positively correlated with the bioaccumulation of BDE-47; therefore the N/P ratio could affect the amount of bioaccumulated BDE-47 by altering the lipid content.

N/P ratio; Polybrominated diphenyl ethers (PBDEs); Bioaccumulation; Microalgae

X171.5

A

1000-3207(2014)05-0841-07

10.7541/2014.126

2013-07-10;

2013-12-22

國家自然科學基金項目(40906061); 山東省“兩區”建設專項資金項目(2011-黃-19); 青島市公共領域科技支撐計劃(12-1-3-64-nsh); 青島農業大學高層次人才啟動基金項目(630642)資助

葛蔚(1971—), 男, 黑龍江省伊春人; 副教授; 主要從事生物化學方面研究。E-mail: gwi2050@126.com

柴超, E-mail: chaichao1999@126.com