干細胞標志分子在豬臍帶組織中的表達

余樹民，凌占業,2，劉 丹，劉歡歡，夏 娟，沈留紅，曹隨忠，左之才，鄧俊良，任志華，馬曉平，王 婭，胡延春

(1 四川農業大學 動物醫學院，環境公害與動物疾病四川省高校重點實驗室，四川 雅安 625014；2 河南省黃泛區鑫欣牧業有限公司，河南 周口 466632)

Oct4、Nanog、Sox2、Rex-1是干細胞自我更新和多潛能性的關鍵調控因子[1-2]，常與胚胎階段特異性抗原(Stage-specific embryonic antigen,SSEA)SSEA-1、SSEA-3和SSEA-4一起被用作鑒定胚胎干細胞(Embryonic stem cells,ES)[3]、胚胎生殖細胞(Embryonic germ cells,EG)[4-5]等多潛能細胞的標志分子。近年來，有許多關于上述標志分子在不同組織器官來源的成體干細胞(Somatic stem cells,SSCs)中表達的研究報道，如性腺[6-7]、骨髓[8-9]、脂肪[8]、皮膚[8]、血液[10]、臍帶[11-16]等，因此許多學者將這些干細胞“干性”標志分子用于評價成體干細胞的多潛能性。臍帶是妊娠時連接母體和胎兒的管狀器官。近年來的研究表明。臍帶是獲取胎兒干細胞的最適來源之一，利用臍帶分離干細胞具有來源豐富、不需要手術取樣和損傷小等優點，且分離成功率可達100%，明顯優于骨髓、臍血和脂肪[17-18]；臍帶來源細胞增殖能力旺盛，呈現堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase, ALP)活性和高端粒酶活性，表達早期胚胎細胞標志分子[11-16，18]。

豬不僅是一種與人類生活息息相關的重要經濟動物，而且是人類異種器官移植的理想來源。多潛能干細胞是豬基因改造和組織器官發育研究的重要起始材料。已有研究顯示，以分化程度低的干細胞作為細胞核移植供核細胞能顯著提高重構胚囊的胚形成率[19-20]。Carlin等[11]報道，豬臍帶來源細胞具有堿性磷酸酶和端粒酶活性，表達Oct4、Nanog和Sox2，體外培養可形成ES樣細胞集落?；诖?，本試驗以豬臍帶為材料，從基因轉錄和蛋白水平研究SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、Oct4、Nanog、Sox2和Rex-1的表達，以期為豬臍帶的利用及其來源細胞在轉基因技術中更好地發揮作用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗材料 豬臍帶采自四川某規?；i場三元雜交(長白×大白×杜洛克)種豬足月分娩的仔豬，共采集臍帶20份；hES-18細胞RNA由西北農林科技大學國家干細胞工程技術中心陜西分中心華進聯教授惠贈，作為試驗陽性對照；Hela細胞由四川農業大學動物醫學院動物生物技術中心保存，作為試驗陰性對照。

1.1.2 主要試劑 免疫組化用一抗為兔抗人Nanog和Sox2多克隆抗體，以及鼠抗人 Oct4、SSEA-1、SSEA-3和SSEA-4單克隆抗體等，免疫組化用二抗為通用羊抗兔和羊抗鼠抗體，以及顯色試劑盒等，均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。分子生物學實驗用試劑焦碳酸二乙酯 (DEPC)、DNA Marker、RNA保存液、總RNA抽提試劑盒(Simple total RNA Kit)和PCR 2×Master Mix等，購自北京天根生化科技有限公司。PMD19-T Simple Vector、PrimeScript?RT reagent Kit等，購自大連寶生物工程有限公司。

1.1.3 引物設計與合成 以GenBank收錄的基因Oct4(GenBank登錄號：DQ486513)、Nanog(GenBank登錄號：AY230262)、Sox-2(GenBank登錄號：Z31560)、Rex-1(GenBank登錄號：AF450454)和β-actin(GenBank登錄號：DM_001101.3)的cDNA序列為模板，利用Primer 5.0軟件設計引物，引物序列和產物長度詳見表1。引物合成由上海生物工程有限公司完成。

1.2 方 法

1.2.1 臍帶組織總RNA的抽提 將豬臍帶樣品用無RNA酶磷酸鹽緩沖液(PBS)反復漂洗去除血凝塊與污物，剪碎，用RNA凍存液-20 ℃保存備用。試驗時，按RNA 抽提試劑盒說明書分別抽提臍帶組織和Hela細胞(陰性對照)的總RNA。

1.2.2 RT-PCR檢測分析和擴增片段測序 按照PrimeScript?RT試劑盒說明書分別將各樣品總RNA(包括Hela細胞)及hES-18細胞RNA(陽性對照)反轉錄為cDNA，再取cDNA按下述反應條件在PCR儀(型號MyCycler，美國BIO-RAD)上進行PCR反應，檢測各樣品中基因Oct4、Nanog、Sox2、Rex-1和β-actin的轉錄情況，以β-actin作為內參照。PCR反應體積均為20 μL，包括2×PCR Master Mix 10 μL、樣品cDNA 2.0 μL、上下游引物各1.0 μL和雙蒸水6 μL。PCR反應條件為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性35 s，按表1所示溫度退火35 s，72 ℃延伸40 s，35個循環；最后72 ℃延伸10 min。反應完畢，擴增產物于10 g/L瓊脂糖凝膠上電泳(90 mV，30 min)，凝膠成像儀(型號GelDoc 2000，美國BIO-RAD)觀察并記錄電泳圖像。試驗重復3次。利用Quantity One軟件將電泳圖像中各目的條帶的灰度值換算為具體數值，其與β-actin電泳條帶灰度值的比值即為目的基因在樣品中的mRNA相對表達量，計算公式為：目的基因mRNA相對表達量=目的基因條帶灰度值/β-actin基因條帶灰度值。

用DNA回收試劑盒分別回收臍帶組織基因Oct4、Nanog、Sox2、Rex-1的PCR擴增片段，將其與測序載體PMD19-T連接，送華大基因有限責任公司測序。用Blasta軟件將測序結果分別與相應基因的引物設計模板(見1.1.3)進行同源比對。

表1 檢測基因的引物序列、退火溫度和產物長度

1.2.3 臍帶組織的免疫組化分析 將豬臍帶樣品浸入40 mL/L多聚甲醛溶液中固定，經常規沖洗、脫水、透明化、石蠟包埋、切片、烘片等程序制作組織切片，備用。部分切片經蘇木精/伊紅(HE)染色，觀察組織形態結構，其中細胞核會被染成藍色，胞漿染為紅色。

免疫組化染色用于鑒定干細胞標志分子Oct4、Nanog、Sox2、SSEA-1、SSEA-3和SSEA-4蛋白抗原在臍帶組織中的表達。Oct4、Nanog和Sox2作為一抗進行免疫組化染色時，需對組織切片進行抗原修復，其余操作與SSEA-1、SSEA-3和SSEA-4作為一抗的試驗操作相同，均按SP免疫組化試劑盒說明書進行操作，即將切片或經抗原修復的切片用雙氧水處理，然后分別與一抗孵育，4 ℃過夜，清洗，再根據所用一抗加入羊抗兔或羊抗鼠二抗孵育，清洗后滴加顯色試劑DAB顯色，漂洗后脫水透明，于顯微鏡下觀察照相，組織切片背景為微黃色或無色，反差強而能辨認即進行判定，切片中呈棕褐色、棕黃色、棕紅色的為陽性細胞，說明該細胞表達一抗對應的蛋白抗原。其中，Oct4、Nanog和Sox2為核蛋白抗原，SSEA-1、SSEA-3和SSEA-4為胞漿或膜抗原，免疫組化染色切片未進行復染。

1.3 統計學分析

所得試驗數據用“平均值±標準差(x±SD)”表示，用SPSS 13.0軟件進行方差分析，P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 豬臍帶組織中干細胞“干性”調控關鍵轉錄因子基因的RT-PCR

RT-PCR結果顯示，從20份臍帶樣品中均擴增出干細胞“干性”調控關鍵基因Oct4、Nanog、Sox2和Rex1(部分樣品擴增結果見圖1)的目的條帶；用同一引物和相同的PCR擴增條件也顯示，陽性對照hES-18細胞強陽性表達基因Oct4、Nanog、Sox2和Rex1，陰性對照Hela細胞不表達這4個基因(見圖1)；將臍帶組織基因Oct4、Nanog、Sox2和Rex1的PCR擴增片段分別回收并進行測序，顯示各基因擴增片段序列與其模板(GenBank登錄號分別為NR_002304、NM_024865、NM_003106和NM_174900)的同源性分別為98%，99%，100%和98%。該結果說明，本試驗所用引物及反應條件特異擴增了各個目的基因，豬臍帶組織轉錄表達干細胞“干性”調控關鍵基因Oct4、Nanog、Sox2和Rex1。

由表2可知，NanogmRNA相對表達量顯著低于Oct4 mRNA、Sox2 mRNA和Rex1 mRNA，而Oct4 mRNA、Sox2 mRNA和Rex1 mRNA的相對表達量無顯著性差異。

圖1 豬臍帶部分樣品中Oct4、Nanog、Sox2和Rex1基因表達的RT-PCR電泳結果

表2 豬臍帶組織中基因Oct4、Nanog、Sox2和Rex1 mRNA的相對表達量

2.2 豬臍帶組織中胚胎干細胞標志分子表達的免疫組化分析

以Oct4、Nanog、Sox2、SSEA-1、SSEA-3和SSEA-4為一抗的免疫組化分析結果如圖2所示，試驗臍帶樣品的統計結果見表3。由圖2和表3可知，75%以上豬臍帶樣品陽性表達Oct4、Nanog、Sox2、SSEA-1、SSEA-3和SSEA-4蛋白抗原，陽性細胞不同程度地被染成棕褐色、棕紅色或棕黃色；Nanog呈陽性染色的樣品數量明顯較Oct4、Sox2、SSEA-1多，但在組織切片上其著色強度明顯較后三者弱，而Sox2、SSEA-1的著色程度明顯強于Oct4、Nanog、SSEA-3和SSEA-4。圖2還顯示，陽性細胞主要分布于臨近血管的華通氏膠區域，細胞多為橢圓形和圓形，多數單個散在，也有少數成簇聚集。組織切片H/E染色結果(圖2)顯示，血管周圍及華通氏膠區域分布較多單個散在的小細胞，這類細胞呈蘇木精深染。

圖2 豬臍帶組織HE染色及其免疫組化分析

表3 多潛能細胞標志分子在豬臍帶組織中表達的免疫組化檢測(n=20)

3 討 論

盡管有報道指出，臍帶源原代細胞能形成ES樣細胞集落，但傳代后均呈纖維樣細胞形態[12-13]。而目前從臍帶分離的主要是間充質干細胞(Mesenchymal stem cells,MSC)，雖已有一些關于臍帶來源細胞表達ES細胞標志分子的研究報道，但其結果并不完全一致。在人上，Jo等[12]和Fong等[13-14]分別報道臍帶源MSC表達Oct4、Nanog、Sox2、SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-81，但關于SSEA-1、SSEA-3表達的結果卻不盡一致；Carlin等[11]、Lee等[16]分別報道豬和犬的臍帶基質細胞表達Nanog、Oct4、Sox2，其中犬臍帶基質細胞還表達SSEA-4。Hoynowski等[15]報道，馬臍帶基質細胞表達Oct4、SSEA-3、SSEA-4、Tra-1-60、c-Kit、CD133和C-myc。綜觀以上研究，其均以體外培養的細胞為材料，而不同培養條件會使基因表達呈現不同的特點[21-22]，所以體外培養的細胞不一定能真實反映臍帶組織的基因表達狀況。本試驗中，RT-PCR和免疫組化分析結果顯示，豬臍帶組織在基因轉錄和蛋白質水平均表達Oct4、Nanog、Sox2，同時也轉錄表達Rex-1 mRNA，結果與Carlin等[11]、Jo等[12]、Fong等[13-14]和Lee等[16]的結果一致；免疫組化分析結果還顯示，豬臍帶組織表達SSEA-1、SSEA-3和SSEA-4抗原，與Jo等[12]、Fong等[13-14]、Hoynowski等[15]以及Lee等[16]的結果部分一致，SSEA表達特點與Tsung等[23]報道的豬胚胎生殖細胞一致，提示臍帶可能存留有未分化原始生殖細胞。本試驗中，豬臍帶組織切片的H/E染色結果顯示，臨近血管的華通氏膠區域分布有較多體積小且以胞核著色為主的細胞，但目前還未見從臍帶獲得類ES細胞或EG細胞的報道；另外，臍帶來源MSC所表現的早期未分化干細胞特點是其本身所為，還是因為其中含有多潛能性早期胚胎細胞，或者含有最近報道的極小胚胎樣干細胞(Very small embryo-like cells, VSEL)[24]，尚需要進一步研究。

有研究指出，Oct4并不是SSCs自我更新和多能性維持所必需的轉錄因子[9，25]，Nanog是人MSC多潛能調控因子[9]。Arnold等[26]指出，Sox2是早期胚胎、胎兒和出生后個體等不同發育階段各類型干細胞或未成熟前體細胞共同表達的標志分子，是機體各種干細胞/前體細胞自我更新和保持分化潛能所必需的內源性轉錄因子。本試驗結果顯示，不管是基因轉錄水平還是蛋白水平，Sox-2均呈現高表達，根據Arnold等[26]的結果推斷，這可能與臍帶再生有關；另外，筆者注意到Oct4 mRNA表達量與Sox-2 mRNA差異不顯著，但免疫組化分析結果顯示其呈弱表達，這一差異可能與部分Oct4 mRNA無翻譯功能有關，或者是Oct4表達假基因的結果，因為有報道指出，在很多情況下Oct4存在假基因表達的現象[27]。

本研究在mRNA轉錄和蛋白水平上證實，多潛能性細胞標志分子Oct4、Nanog、Sox2、SSEA-1、SSEA-3和SSEA-4在豬臍帶組織中表達，SSEA表達特點與豬胚胎生殖細胞一致，提示豬臍帶組織中可能含有早期未分化的多潛能細胞。

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