凍藏溫度對河豚魚魚肉微觀結構及生化指標的影響

馬 妍，謝 晶，周 然，劉 源

(上海海洋大學 食品學院，上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 201306)

河豚魚又名鲀魚，屬于硬骨魚綱鲀形目鲀科，是暖水性海洋底棲魚類，廣泛分布于北太平洋西部，在我國各大海域都有捕獲。河豚魚肉質鮮美，含有豐富的不飽和脂肪酸，營養價值極高，與鰣魚、刀魚并稱為“長江三鮮”。在我國，河豚魚有30余種，常見的有黃鰭東方鲀、蟲紋東方鲀、紅鰭東方鲀、暗紋東方鲀等，隨著河豚魚養殖技術的發展，暗紋東方鲀(Takifuguobscurus)以生長較快且肌肉無毒的特點而在長江流域的漁場里得到較快的發展[1]。

近年來，單一的活魚銷售已經不能滿足河豚魚產量日益增長的需求，凍藏是魚類貯藏的主要方式之一，但是冷凍貯藏可能對魚肉的品質產生較大的影響，而目前對于河豚魚的凍藏研究較少。本試驗對河豚魚凍藏過程中魚肉生化指標以及魚肉質構和肌肉微觀結構的變化進行了研究，旨在為河豚魚的冷凍加工提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

暗紋東方鲀，由上海能正漁業科技開發有限公司提供。主要儀器有Sartorins PB-10精密數顯酸度計、Kjeltec2300凱氏定氮儀、TDL-5-型低速離心機、Unico 2100分光光度計、TA-XT2i質構分析儀、JEM2100透射電子顯微鏡。

1.2 樣品處理

將新鮮的暗紋東方鲀去頭及內臟，用冰水洗凈，瀝干，分塊，分5組裝袋，分別置于-(10±1) ℃、-(18±1) ℃、-(25±1) ℃、-(30±1) ℃和 -(86±1) ℃ 低溫冰箱中冷凍保藏，每隔30 d取樣1次，進行理化指標測定。

1.3 測定指標與方法

將冷凍的河豚魚塊置于4 ℃冰箱中解凍12 h，取解凍后樣品用于各理化指標的測定。

1.3.1 pH值 將樣品魚肉剁碎后，取5 g于燒杯中，加入45 mL中性蒸餾水，攪拌均勻，靜置30 min，然后用精密數顯酸度計測定pH值[2]。

1.3.2 硫代巴比妥酸(2-thiobarbituric acid，TBA)值 參照Salih等[3]的方法并加以改進。準確稱取河豚魚肉5 g，切碎置燒杯中，加入15 mL體積分數20%三氯乙酸溶液(TCA)和10 mL蒸餾水，勻漿60 s，靜置1 h后過濾，濾液用蒸餾水定容至50 mL，取5 mL濾液備用，加入5 mL硫代巴比妥酸溶液(TBA，0.02 mol/L)，沸水浴中反應20 min，取出，流動水冷卻5 min后用分光光度計在532 nm處測吸光度A532，重復3次。取25 mL體積分數 20%TCA用蒸餾水定容到50 mL，靜置過濾后取5 mL濾液加5 mL硫代巴比妥酸溶液，采用上述方法進行測定，作為分光光度計的空白對照。按下式計算TBA值：TBA=A532×7.8 mg/hg。

1.3.3 揮發性鹽基氮(Total volatile basic nitrogen，TVB-N)含量 利用半微量凱氏定氮的原理，準確稱取絞碎的河豚魚魚肉5 g于350 mL消化管中，設置吸收液量為30 mL，自動加蒸餾水量為30 mL，加堿量為0 mL，模式為delay，在裝有樣品的消化管瓶中加入5 g氧化鎂粉末，迅速放入凱氏定氮儀進行測定[4]。

1.3.4 質構分析 采用TA-XT2i質構分析儀對樣品進行質構分析。分析探頭為直徑6 mm的P-6柱形探頭，利用TPA模式，測試速率為1 mm/s，壓縮程度為30%，每種處理重復測試6次。本試驗采用的質構參數硬度定義為第一次壓縮時的最大峰值[5]。

1.3.5 肌肉微觀結構觀察 參照Taylor等[6]的方法，將魚肉切成長×寬×高為2 mm×3 mm×10 mm大小的薄片，經磷酸緩沖液漂洗后，加入體積分數 2.5% 的戊二醛溶液，置于4 ℃條件下預固定2 h；將樣品取出，用磷酸緩沖液漂洗1 h，放入體積分數1%的鍔酸溶液中再次固定1 h；取出樣品后分別用體積分數30%，50%，70%，80%，90%和100%的乙醇進行脫水，脫水后用Epon812環氧樹脂對樣品進行包埋，然后制成超薄切片，采用醋酸鈾和檸檬酸鉛雙染色法進行染色，最后使用JEM2100透射電子顯微鏡對魚肉的微觀結構進行觀察。

1.3.6 鹽溶性蛋白含量 取魚肉5 g加0.6 mol/L氯化鉀30 mL，于4 ℃離心(3 000 r/min) 10 min，取上清液采用雙縮脲法[7]測定蛋白含量。

1.3.7 巰基含量 參照Benjakul等[8]的方法，取1 mL的肌動球蛋白 (質量分數0.4%)，加入9 mL 0.2 mol/L的Tris-HCl緩沖液，混勻后取4 mL混合溶液，加入0.4 mL質量分數1% 的DTNB，于40 ℃培養25 min后，用分光光度計在412 nm處測吸光度A412， 空白對照以pH 7.0的0.6 mol/L KCl代替樣品。根據測定的A412值，結合標準曲線計算巰基蛋白含量。

1.4 數據統計

采用SPSS17.0軟件的Duncan法對試驗數據進行多重比較和方差分析，P<0.05表示差異顯著。利用Origin Pro 8.0繪制曲線。

2 結果與討論

2.1 凍藏過程中河豚魚魚肉pH值的變化

在魚肉凍藏過程中，隨著凍藏時間的延長，魚肉中的蛋白質在一些酶的作用下逐漸分解產生氨基酸及其他堿性物質，同時細菌利用氨基酸及其他含氮小分子產生氨及胺類，導致pH值上升。由圖1可以看出，河豚魚魚肉的pH值隨著凍藏時間的延長逐漸上升，并且凍藏溫度越高，pH值上升幅度愈大，-86 ℃時魚肉的pH值上升最慢。由此可知，凍藏溫度越高，魚肉pH值相應越高，較低的凍藏溫度可有效延緩魚肉蛋白的分解，減緩pH值的上升。

圖1 凍藏過程中河豚魚魚肉pH值的變化

2.2 凍藏過程中河豚魚魚肉TBA值的變化

河豚魚魚肉中含有豐富的不飽和脂肪酸，極易氧化。而且凍結使魚肉的自由水含量減少，增加了剩余溶液的濃度，使氧化速率加快[9]。在凍藏過程中，河豚魚肉TBA含量的變化動態如圖2所示。由圖2可知，凍藏時間越長，凍藏溫度越高，魚肉TBA含量越高，差異越明顯(P<0.05)。在-10，-18，-25，-30和-86 ℃下凍藏180 d后，TBA含量由最初的 0.030 3 mg/hg分別上升至1.014 1，0.760 5，0.522 6，0.382 2 和0.230 1 mg/hg，說明較低溫度的凍藏有利于減緩脂肪的氧化。Aubourg等[10]研究指出，鱈和黑線鱈在-10，-30 ℃凍藏12周后，TBA含量分別上升345.5%，136.4%和 61.5%，19.2%，與本試驗結論相類似。

2.3 凍藏過程中河豚魚魚肉TVB-N含量的變化

TVB-N是魚肉蛋白質腐敗過程中，因酶和細菌的分解作用產生的氨和胺類等堿性含氨物質。TVB-N含量是魚類等動物性食品鮮度的重要衡量指標。凍藏過程中河豚魚魚肉TVB-N含量的變化如圖3所示。

圖3 凍藏過程中河豚魚魚肉TVB-N含量的變化

圖3顯示，新鮮河豚魚魚肉的TVB-N含量為 9.04 mg/hg；在凍藏過程中，隨著凍藏時間的延長，TVB-N含量逐漸上升，且凍藏溫度越高，TVB-N值上升越快，-10，-18，-25,-30和-86 ℃條件下凍藏結束時，河豚魚魚肉TVB-N的含量分別達到 20.83，17.71，16.59，15.64和14.54 mg/hg，分別較新鮮河豚魚魚肉上升了130.42%，95.91%，83.52%，73.01%和60.84%。說明低溫凍藏可減慢河豚魚魚肉TVB-N的變化。

2.4 凍藏過程中河豚魚魚肉質構的變化

隨著冷凍貯藏期的延長，魚肉的質構會發生一些不可逆的不良反應，從而影響魚類的食用價值，所以研究魚類冷凍貯藏期間的質構變化顯得尤為重要。傳統的方法一般采用感官評價來反映食品質構的變化，如食用口感等指標，然而這種評價易受其他因素的影響，如經驗、個人嗜好、環境等，并且重現性低。因此，借助質構儀對影響消費者口感的主要因素及食品的一些物理特性進行分析更具實際意義[9]。魚肉的質構特性變化通過TPA (Texture profile analysis)來反映，采用由儀器分析得到的TPA可以避免感官評價時因分析人員不同而造成的主觀誤差[11]。由圖4可知，隨著凍藏時間的延長，河豚魚魚肉的硬度呈降低趨勢，且凍藏溫度愈低硬度變化愈明顯，在-10，-18，-25，-30和-86 ℃下凍藏180 d后，河豚魚魚肉的硬度分別降低了26.82%，35.38%，41.14%，45.59%和52.61%。

2.5 凍藏過程中河豚魚魚肉微觀結構的變化

由圖5-a可以看出，新鮮魚肉肌纖維連接緊密，呈現出良好的肌肉結構形態，因而質地較好。通過比對可知，冷藏期間，魚肌肉纖維均有不同程度的分離，由于肌肉細胞骨架與肌節和肌內膜發生了分離而呈現撕裂狀態(圖5-b-f)，但在不同冷藏溫度下表現并不相同：-10 ℃條件下，魚肉的肌肉纖維稍有分離；-18 ℃下，魚肉的肌肉纖維密度略低于 -10 ℃；-25 ℃下的魚肉肌纖維較前兩者更疏，肌肉纖維之間有明顯的空隙；-30 ℃下的魚肉肌纖維和-25 ℃下差別不大；而在-86 ℃條件下，肌肉纖維已經大部分分離，纖維之間出現大量空隙，甚至出現纖維斷裂。由此可知，溫度越低，河豚魚魚肉的肌肉纖維分離得越明顯，這可能是由于低溫凍結時魚肉中的水分形成大量的冰晶，破壞了魚肉的纖維結構所致。

圖5 凍藏條件下河豚魚魚肉微觀結構的變化

通過比較魚肉硬度的變化，發現在魚肉硬度下降的同時，魚肉的肌肉纖維也在發生著分離與斷裂。由此可知，魚肉肌纖維之間的連接程度與魚肉硬度的變化有密切關系，肌肉纖維之間連接得越緊密，魚肉硬度越大[12]。

2.6 凍藏過程中河豚魚魚肉鹽溶性蛋白含量的變化

蛋白質的鹽溶性是反映魚肉蛋白變性的一個常用指標，在凍藏過程中，氫鍵、疏水性和二硫鍵等的形成往往導致蛋白質的鹽溶性下降，而且下降程度與凍藏溫度相關。鹽溶性蛋白含量下降意味著肌肉中的蛋白質發生了冷凍變性，蛋白含量下降越多，表明其變性程度越嚴重。引起凍藏過程中魚肉蛋白質變性的因素很多，包括凍藏條件、脂肪含量、二硫鍵及其相互作用等[13]。也有人認為，魚肉蛋白中的結合水在凍藏過程中形成冰晶并析出是導致魚肉蛋白質變性的原因之一[14]。

由表1可知，在凍藏過程中，貯藏時間愈長，溫度愈高，河豚魚魚肉中的鹽溶性蛋白含量下降愈明顯。在-10，-18，-25，-30和-86 ℃下凍藏180 d后，河豚魚魚肉中的鹽溶性蛋白含量由最初的 44.06 mg/g分別下降為5.77，9.33，11.87，14.69和 17.31 mg/g，分別降低了86.90%，78.82%，73.06%，66.66%和60.71%。

表1 凍藏對河豚魚魚肉鹽溶性蛋白含量的影響

2.7 凍藏過程中河豚魚魚肉巰基含量的變化

低溫凍藏過程中河豚魚魚肉巰基含量的變化動態如圖6所示。

圖6 凍藏條件下河豚魚魚肉巰基含量的變化

根據圖6可知，河豚魚魚肉中的巰基含量隨著凍藏時間的延長而逐漸下降；貯藏溫度越高，巰基含量降低得愈快，在-10，-18，-25，-30和-86 ℃下凍藏180 d后，魚肉中的巰基含量分別由最初的0.535 μmol/g降到0.057，0.088，0.115，0.146和0.239 μmol/g，平均下降速率為2.66×10-3，2.48×10-3，2.33×10-3，2.16×10-3和1.64×10-3μmol/(g·d)。說明低溫凍藏有助于減緩魚肉中巰基的減少。Jiang等[15]在研究不同溫度下凍藏鱈魚巰基含量變化時也得出了相似的結論。巰基含量的下降可能是因為冰晶的形成使肌原纖維蛋白的空間結構發生了改變，進而使埋藏在分子內部的巰基活性基團暴露出來而被氧化成二硫鍵，從而導致巰基含量減少[16]。

3 結 論

凍藏溫度不同，貯藏過程中河豚魚魚肉各種品質指標的變化不同，并且隨著貯藏時間的延長差異會更加明顯。凍藏溫度愈低，河豚魚魚肉的pH、TBA值及TVB-N、鹽溶性蛋白和巰基含量的變化愈小。

采用TPA模式對河豚魚魚肉的硬度進行測定，結果表明隨著凍藏時間的延長，魚肉的硬度緩慢下降；凍藏溫度越低，魚肉硬度的變化趨勢越明顯。

通過透射電子顯微鏡對魚肉的微觀結構進行觀察，發現魚肉肌肉纖維的疏松程度與魚肉的硬度相關聯，肌肉纖維連接得越緊密，魚肉的硬度越大。

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