早酥梨及其紅色芽變Ty1-copia反轉錄轉座子逆轉錄酶的克隆與分析

周 鵬，仇宗浩，翟 銳，梁 東，徐凌飛

(西北農林科技大學 園藝學院，農業部西北地區園藝作物生物學與種質創制重點實驗室，陜西 楊凌712100)

反轉錄轉座子是植物基因組中可以自由移動的基因片段，轉座子通過DNA-RNA-DNA的方式，發生逆轉錄后整合到基因組中的新位點，可以影響其他基因的表達和基因組的變化，創造穩定的插入突變[1-2]。反轉錄轉座子在植物基因組分析[3]、連鎖作圖[4]、系統進化[5-6]及生物多樣性研究[7]等方面具有廣泛的應用前景。逆轉錄酶是反轉錄轉座子發生轉座的重要調控因子，其序列的保守性影響著轉座的發生。

迄今為止，已有許多反轉錄轉座子在果樹中被分離和鑒定，用以研究其對果樹基因組組成、系統進化以及基因表達調控方面的重要作用[8-10]。孫俊等[11]應用改良的Pearce方法，分離了蘋果Ty1-copia反轉錄轉座子RNaseH-LTRs序列；Tao等[12]發現，反轉錄轉座子是導致柑橘基因組突變和進化的重要原因，芽變的逆轉錄酶序列存在移框、缺失等多種突變情況；Rico-Cabanas等[13]首次從柑橘中獲得完整的copia反轉錄轉座子CIRE1，并發現其在根中特異表達。另有研究表明，反轉錄轉座子的插入導致果樹性狀發生了改變，如Harada等[14]研究發現，蘋果一個耐貯藏突變品種可能是ACC合成酶基因啟動子-781 bp處插入了一個162 bp的類似反轉錄轉座子片段所致；Yao等[15]研究發現，RaeIme等單性結實的蘋果芽變是由于反轉錄轉座子插入MdPI基因內含子影響其表達而產生的性狀；Kobayashi等[16]研究表明，紅皮葡萄芽變Ruby Okuyama和Flame Muscaty，分別是由Gret1反轉錄轉座子插入白皮葡萄Italia和Muscat of Alexandria的Vvmyb1基因中所致。Ty1-copia反轉錄轉座子逆轉錄酶具有異質性和高拷貝的特點，已經在火龍果[17]、蘋果[18]、草莓[19]、黃瓜[20-21]、白菜[22]等植物中得到驗證。目前，只有Shi等[23]和Kim等[24]對日本梨Ty1-copia反轉錄轉座子進行了鑒定分析，但從梨母本和芽變基因組中分離逆轉錄酶序列并進行分析的研究卻鮮見報道。本研究擬從早酥梨及其紅色芽變基因組中克隆Ty1-copia反轉錄轉座子逆轉錄酶序列，并運用生物信息學技術對其進行對比分析，以期通過研究Ty1-copia反轉錄轉座子探索早酥梨與其紅色芽變的遺傳關系，進而為早酥梨的遺傳進化提供信息支持。

1 材料與方法

1.1 材 料

以白梨品種“早酥”及其紅色芽變葉片為試材，2011-04從西北農林科技大學梨種質資源圃采集幼葉，立即用液氮速凍后，-70 ℃保存備用。試驗在農業部西北地區園藝作物生物學與種質創制重點實驗室進行。采用改良的SDS酚法提取葉片總DNA[25]，用8 g/L瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop2000(Thermo)儀器檢測DNA質量濃度和純度。用TE緩沖液稀釋DNA至100 ng/μL，保存于-20 ℃冰箱中備用。

1.2 逆轉錄酶序列的克隆

根據Ty1-copia反轉錄轉座子逆轉錄酶保守基序Ⅰ(TAFLHG)和Ⅲ(YVDDML)設計擴增基因片段的簡并引物[26]，上游引物NM1的序列為5′-ACNGCNTTPyPyTNCAPyGG-3′，下游引物NM2的序列為5′-APuCATPuTCPuTCNACPuTA-3′，其中N=A+T+C+G，Pu=A+G，Py=T+C。

PCR反應體系25 μL：10×TaqBuffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl21.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 0.8 μL，5 U/μLTaq聚合酶(Fermentas) 0.2 μL，10 μmol/L引物各1 μL，ddH2O補足至25 μL。以早酥梨DNA為模板，建立并優化梨Ty1-copia反轉錄轉座子逆轉錄酶序列的PCR反應體系。將PCR反應體系中的MgCl2、dNTP、引物、Taq酶等成分設置不同的用量(表1)，當一種成分的用量發生改變時，保持其他成分用量不變，通過擴增效率的對比分析確定各成分的最佳用量。

表1 早酥梨Ty1-copia反轉錄轉座子逆轉錄酶序列PCR體系的優化

PCR反應程序為：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性1 min，設置不同的退火溫度(45.9，47.5，49.5，51.5，53.2，55.0，57.0 ℃)復性50 s，72 ℃延伸50 s，35個循環；最后72 ℃延伸5 min。整個反應在Life-Express PCR反應儀中完成。PCR產物用15 g/L瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

1.3 逆轉錄酶序列的獲得及分析

在紫外燈下對凝膠拍照后，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Biomiga)回收目的片段，與pGM-T (TIANGEN)載體于16 ℃連接8～10 h。連接產物轉化到Top10大腸桿菌感受態細胞中，涂于含有Amp/X-gal/IPTG 的LB 固體培養基上，37 ℃過夜培養后，挑取白色克隆，在含有100 mg/L氨芐青霉素的 LB 液體培養基中培養。將每個經過檢測的陽性克隆分裝成2個，送往北京奧科鼎盛生物科技有限公司利用T7或SP6引物測序，獲得目的基因序列。

在NCBI網站對測序結果進行BLASTN，用BLASTX程序進行同源比對，搜索庫中已知物種的逆轉錄酶序列，利用DNAStar軟件對序列進行聚類分析，用Mega 5.0軟件構建系統進化樹。

1.4 Ty1-copia反轉錄轉座子轉錄活性的檢測

采用改良的SDS酚法提取葉片RNA，利用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)試劑盒去除基因組DNA，將RNA反轉錄成cDNA，分別以RNA和cDNA為模板PCR擴增Actin(GU830958)基因用以檢測樣品質量。以cDNA為模板，利用已經優化好的體系擴增逆轉錄酶序列，檢測早酥梨及其紅色芽變Ty1-copia反轉錄轉座子的轉錄活性。

2 結果與分析

2.1 早酥梨逆轉錄酶序列PCR擴增體系的建立與優化

以早酥梨DNA為模板，根據表1將PCR反應體系中的MgCl2、dNTP、引物、Taq酶等成分設置不同用量進行擴增，結果如圖1所示。

圖1 不同組分PCR反應體系擴增早酥梨逆轉錄酶的檢測結果

由圖1可以看出，不同的PCR擴增體系中，隨組分及用量的變化，PCR擴增效率亦會隨之改變。隨著dNTP用量的增加，PCR產物增多，以1.2 μL dNTP時的擴增產物最多；雖然取用0.3 μLTaq酶時逆轉錄酶的擴增效率較高，但同時出現了非特異性產物，故選用0.2 μLTaq酶進行擴增；不同的引物用量對逆轉錄酶序列的擴增也有影響，隨著引物用量增大擴增產物減少，故確定引物用量為0.8 μL；當MgCl2用量為 1.5 μL時，擴增產物具有特異性。所以，經過優化后的PCR反應體系為：10×TaqBuffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl21.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 1.2 μL，5 U/μLTaq聚合酶0.2 μL，10 μmol/L 引物各0.8 μL。

同時，為進一步優化反應程序，設置不同的退火溫度進行擴增試驗，結果(圖2)顯示，不同退火溫度時的PCR擴增效率不同，51.5 ℃為逆轉錄酶PCR擴增體系的最佳退火溫度。

圖2 退火溫度對早酥梨逆轉錄酶PCR擴增結果的影響

2.2 早酥梨及其紅色穿變逆轉錄酶的擴增與檢測

利用優化后的PCR體系在早酥梨及其紅色芽變基因組中都能得到擴增產物(圖3)，長度約為260 bp，從片段大小尚未看出二者有何差異。經過測序比對，成功從早酥梨基因組中獲得45條逆轉錄酶序列，從芽變基因組中獲得60個克隆。所得序列中，除早酥梨2個序列的BLASTX比對結果與一種轉座酶相似外，其余序列均與Ty1-copia反轉錄轉座子逆轉錄酶序列有很高的相似性。經聚類分析，將小于200 bp的序列去掉，并將相同的序列歸為1個，最后按照順序，將所得的29條早酥梨Ty1-copia反轉錄轉座子逆轉錄酶序列命名為PbRTzs1～PbRTzs29，將30條紅色芽變逆轉錄酶序列命名為PbRTyb1～PbRTyb30?，F已將59條序列全部提交到NCBI數據庫，登錄號見表2。

圖3 早酥梨及其紅色芽變逆轉錄酶序列的 PCR 擴增

表2 早酥梨及其紅色芽變逆轉錄酶序列的組成

2.3 早酥梨及其紅色芽變Ty1-copia反轉錄轉座子逆轉錄酶的序列對比

從早酥梨及其紅色芽變基因組中克隆到的逆轉錄酶，序列大小與前人的報道一致[18,22]。其中，PbRTyb8和PbRTyb9的長度分別為272和274 bp，雖比較特殊，但在Voytas等[26]的研究中也有發現。從表2可以看出，早酥梨基因組中的逆轉錄酶序列大小為212～268 bp，AT/GC為1.12～1.61，而紅色芽變的逆轉錄酶序列大小為217～274 bp，AT/GC為1.12～1.90。將2組序列分別導入DNAStar軟件運用ClustalW[27]方法計算序列之間的差異性和同源性，結果顯示，早酥梨逆轉錄酶序列的差異度為0.4%～89.8%，相似性為48.3%～99.6%；其芽變逆轉錄酶序列之間的差異度為 1.5%～96.3%，相似性為45.8%～98.5%。2種材料逆轉錄酶序列的大小及堿基變化，反映了梨基因組中的Ty1-copia反轉錄轉座子逆轉錄酶同樣具有異質性特點。

利用DNAStar軟件將逆轉錄酶序列模擬合成氨基酸序列，發現均不含內含子。參考BLASTX比對結果中的Ty1-copia反轉錄轉座子逆轉錄酶氨基酸序列，對早酥梨及其紅色芽變逆轉錄酶氨基酸序列進行分析，結果(圖4和圖5)發現，早酥梨Ty1-copia反轉錄轉座子逆轉錄酶保守氨基酸的一致性為62.22%，芽變的一致性為53.30%，且均可以找到逆轉錄酶序列的3段保守區域“TAFLHG”、“KSLYGLKQ”、“LLYVDDM”以及相對保守的“QP”、“GF”片段。

對早酥梨及其紅色芽變逆轉錄酶氨基酸序列突變情況進行分析，結果見表3。由表3可知，各序列發生了不同種類的突變，主要包括終止子突變、缺失突變和替換突變。具體而言，早酥梨逆轉錄酶序列PbRTzs3由于堿基的替換，出現1個終止子突變(第46個氨基酸)，而且發生在“KSLYGLKQ”保守區域；序列PbRTzs19由于1個堿基的插入，導致后面的序列發生移框，出現了2個終止子突變(第16和86個氨基酸)；PbRTzs28第38個氨基酸發生缺失突變；PbRTzs1和PbRTzs4的保守區域均發生了1個氨基酸替換突變(L變為F)，但未發現缺失突變和移框突變情況。而在紅色芽變的逆轉錄酶序列中，由于堿基替換序列PbRTyb7(第80個氨基酸)、PbRTyb14(第15個氨基酸)、PbRTyb24(第54個氨基酸)、PbRTyb25(第30個氨基酸)存在1個終止子突變，同時序列PbRTyb7由于堿基的替換導致后面序列的移框突變，PbRTyb4(第41和46個氨基酸)存在2個終止子突變，PbRTyb15(第53，55和61個氨基酸)、PbRTyb26(第53，55和61個氨基酸)存在3個終止子突變，PbRTyb9(第9，33，53，67和73個氨基酸)、PbRTyb17(第39，57，78，81和84個氨基酸)、PbRTyb19(第64，65，70，76和84個氨基酸)序列存在5個終止子突變；PbRTyb9序列由于第37位堿基“A”的插入，導致后面序列發生移框突變，PbRTyb7由于缺失突變(第71個氨基酸處)導致隨后的序列發生移碼喪失基因功能，PbRTyb27由于第153處單堿基的插入導致后面的序列發生了移框突變；PbRTyb15(第51個氨基酸開始)、PbRTyb17(第33個氨基酸)、PbRTyb19(第63個氨基酸處)序列同樣發生了缺失突變；PbRTyb1(第1個氨基酸)、PbRTyb4(第34個氨基酸)、PbRTyb6(第4個氨基酸)、PbRTyb9(第34個氨基酸)、PbRTyb11(第4個氨基酸)、PbRTyb17(第34個氨基酸)、PbRTyb19(第34個氨基酸)都發生了替換突變。由此推測，逆轉錄酶序列的異質性是由于終止子突變、缺失突變、替換和移框突變造成的，并且紅色芽變的變異程度明顯高于早酥梨。

圖5 早酥梨紅色芽變Ty1-copia反轉錄轉座子逆轉錄酶氨基酸序列的同源性比較

表3 早酥梨及其紅色芽變逆轉錄酶氨基酸序列突變情況的比較

2.4 早酥梨及其紅色芽變逆轉錄酶基因的系統進化樹

為探明早酥梨基因組中克隆得到的59條序列之間的關系，利用Mega 5.0軟件以Kimura 2-parameter算法，采用鄰接法構建反轉錄轉座子逆轉錄酶的系統進化樹(圖6)。根據進化樹分枝程度可將所有序列分為7個家族(Family 1～7)，代表了來自同一祖先的7個獨立的遺傳家系。其中家族1包括15條序列，家族2包括1條序列，家族3包括14條序列，家族4包括1條序列，家族5包括12條序列，家族6包括2條序列，家族7包括14條序列。

通過進化樹分析，可以找到親緣關系相近的早酥梨及其紅色芽變的逆轉錄酶序列。在各家族的核苷酸序列當中，都有不同程度的突變情況發生。第1家族的序列主要來自于早酥梨，第5家族的序列主要來自于紅色芽變，而在第3和第7家族中，早酥梨和紅色芽變的逆轉錄酶序列各占1/2，第2、第4和第6家族所包含的序列較少且均來自于紅色芽變材料，這3類與其余家族序列的遺傳距離較大，而且第6家族的PbRTyb15和PbRTyb26均是含有3個終止子突變的序列。在這些家族中，由于缺失突變造成序列嚴重不完整，可能已經不具有轉錄活性。

為研究早酥梨與其他物種Ty1-copia反轉錄轉座子的進化關系，從NCBI網站上下載參考序列，包括蘋果(Malus×domestica)ABD76549.1、擬南芥(Arabidopsisthaliana)AAF02855.1、鷹嘴豆(Cicerarietinum)CAD59770.1、柑橘(Citrussinensis)CAJ09951.2、果蠅(Drosophilamelanogaster)CAD27357.1、番薯(Ipomoeabatatas)AAV88069.1、粳稻(OryzasativaJaponica Group)ABA98656.1、楊(Populusdeltoides)CAC95126.1、李(Prunusmume)ACZ36927.1、豇豆(Vignaradiata)AAT90460.1、茄屬(Solanumchilense)AAK29467.1、煙草(Tobacco)P10978.1和玉米(Zeamays)T02087。從每個家族中各選取早酥梨及其紅色芽變的逆轉錄酶序列與其他植物建立進化樹，結果見圖7。從圖7可以看出，早酥梨不同家族的逆轉錄酶氨基酸序列與其他物種的遺傳距離為0.023～1.020。第1，2，4，5和6家族與其他物種的遺傳距離較遠，第3家族的序列與擬南芥(Arabidopsisthaliana)AAF02855.1的序列和玉米(Zeamays)T02087的序列遺傳距離較近；第7家族的氨基酸序列與蘋果(Malus×domestica)和李(Prunusmume)的進化關系非常近，PbRTzs6與二者的遺傳距離分別為 0.023 和 0.035，PbRTyb11與二者的遺傳距離分別為0.083和0.095。不同逆轉錄酶序列與不同物種遺傳距離的差異，可能是由于反轉錄轉座子在進化過程中發生橫向傳遞所致。

圖6 早酥梨及其紅色芽變Ty1-copia反轉錄轉座子逆轉錄酶核苷酸序列的系統進化樹

圖7 早酥梨及其紅色芽變與其他植物Ty1-copia反轉錄轉座子逆轉錄酶氨基酸序列的進化樹

2.5 早酥梨及其紅色芽變Ty1-copia反轉錄轉座子轉錄活性的檢測

由圖8可知，Actin內參基因在早酥梨及其紅色芽變中擴增條帶明亮、無雜帶，說明反轉錄合成的品質很好；以RNA為模板無任何擴增產物產生，說明DNA雜質去除徹底。以cDNA為模板擴增逆轉錄酶序列，則無擴增產物出現，說明Ty1-copia反轉錄轉座子在早酥梨及其紅色芽變植物中已經失去轉錄活性，從而穩定地存在于植物基因組中。

圖8 早酥梨及其紅色芽變Ty1-copia反轉錄轉座子轉錄活性的檢測

3 討 論

Liu等[28]利用早酥梨及其紅色芽變材料構建SSH文庫，發現了與蘋果(NCBI Accession No.AEX97092.1)、麝香百合(NCBI Accession No.ABM68560.1)和水稻(NCBI Accession No.ABA95643.1)Ty1-copia反轉錄轉座子具有較高同源性的EST序列(NCBI Accession No.HO774934)，并以此為切入點探索反轉錄轉座子與芽變發生的關系。前人對蘋果[15]、葡萄[16]等果樹芽變機理的研究結果，已為反轉錄轉座子插入是果樹芽變的重要原因提供了一些證據。已有大量相關報道指出，反轉錄轉座子在植物基因組中發生轉座，是對各種生物或非生物逆境的響應[29-30]。

本研究建立并優化了逆轉錄酶的PCR擴增體系，并成功從早酥梨及其紅色芽變基因組中分離克隆了反轉錄轉座子逆轉錄酶序列。序列分析顯示，堿基替換、插入、缺失所導致的突變，是其具有很高異質性的重要原因，與其他物種逆轉錄酶序列的特點相似[20,22,31]。這可能是由于反轉錄轉座子發生轉座時，逆轉錄酶無錯讀校對功能，從而在轉座過程中易發生高頻突變造成的[30]。另外，反轉錄轉座子之間的同源重組也是導致反轉錄轉座子變異的原因之一[32]。

對逆轉錄酶序列進行分析，發現紅色芽變逆轉錄酶序列突變的復雜程度明顯高于早酥梨，以致大多序列都已經不具有轉錄活性。由于在反轉錄轉座子的轉座過程時，序列很容易突變喪失活性，所以這可作為早酥梨紅色芽變反轉錄轉座子發生了轉座的證據。序列突變導致反轉錄轉座子喪失活性是有積極意義的，可以保證物種的穩定遺傳。植物一方面抑制反轉錄轉座子轉座，防止產生致死突變；另一方面，反轉錄轉座子在逆境中的不斷轉座為基因組的多樣性和遺傳變異奠定了基礎[25]。

利用軟件建立進化樹，分析早酥梨及紅色芽變的逆轉錄酶序列與其他物種逆轉錄酶序列的進化關系，發現只有個別序列(家族7)與蘋果和李具有較近的遺傳距離，甚至小于同一物種逆轉錄酶序列之間的遺傳距離，這可能是反轉錄轉座子橫向傳遞的結果，不同物種可能來自于同一祖先，而縱向傳遞的不穩定性導致同一物種的序列產生了較大的差異。

4 結 論

本研究利用簡并引物首次從早酥梨及其紅色芽變基因組中成功克隆了Ty1-copia反轉錄轉座子逆轉錄酶序列。序列分析結果表明，二者的逆轉錄酶序列都具有高拷貝數和異質性的特點，這主要是由于終止子突變、缺失突變和移框突變所致，而且紅色芽變的逆轉錄酶序列的突變情況更為復雜。根據進化樹分析可知，早酥梨及其紅色芽變與蘋果和李具有很近的遺傳距離，這可能是反轉錄轉座子橫向傳遞的結果。

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