植物鞘氨醇-1-磷酸對暗誘導蠶豆氣孔關閉及保衛細胞胞質pH和NO的影響

馬引利,佘小平,閆 閱

(1 山西師范大學 生命科學學院，山西 臨汾 041004；2 陜西師范大學 生命科學學院，陜西 西安 710062)

鞘脂是一類在許多真核生物的膜結構和機能中起重要作用、且普遍存在的膜脂。成熟鞘脂由1分子脂肪酸與1分子帶有一個極性基團的長鏈堿基(LCB)以酰胺鍵結合而成[1]。哺乳動物中的LCB主要是鞘氨醇；而植物中的LCB有9種，主要是4,8-二烯醇和4-羥基-8-(神經)鞘氨醇的同分異構體，如植物鞘氨醇(Phyto-Sph)和二氫(神經)鞘氨醇[1]。LCBs的磷酸化是具有生物活性的鞘脂代謝物產生的一個重要過程。在真核生物中，LCBs由ATP依賴的LCB激酶(LCBKs)催化生成LCB-1P[2]，LCB-1P(如鞘氨醇-1-磷酸和植物鞘氨醇-1-磷酸)參與調節植物的許多重要的生理過程[3-8]。植物鞘氨醇-1-磷酸(Phyto-S1P)是植物中一種主要的、Δ4飽和的LCBP(C-4和C-5之間無雙鍵)，由鞘氨醇激酶(SphK)催化Phyto-Sph生成。前人的研究結果證明，Phyto-S1P是擬南芥保衛細胞脫落酸(ABA)信號轉導途徑中的重要信號分子[5-7]。ABA處理可顯著提高擬南芥野生型SphK(一種LCBK)的活性，且Phyto-S1P介導ABA調控的氣孔關閉；以擬南芥異三聚體G蛋白a 亞基基因GPA1敲除突變體為材料的研究顯示，Phyto-S1P促進氣孔關閉和抑制氣孔開放的效應被阻斷，這一結果表明，與在動物中一樣，異三聚體G蛋白也是植物Phyto-S1P的下游靶分子[5]。鞘氨醇激酶1(SPHK1)已被證明參與ABA依賴的保衛細胞信號轉導和種子萌發過程[6]。Guo等[7]報道，磷脂酶Dα1(PLDα1)/磷脂酸(PA)和SPHK/Phyto-S1P相互作用共同參與ABA調控的擬南芥氣孔關閉。

胞內pH變化在植物許多生理過程中起重要作用[9-12]。胞質pH變化與氣孔運動調節密切相關。保衛細胞胞質堿化介導ABA和茉莉酸甲酯(MJ)誘導的擬南芥、豌豆和兜蘭的氣孔關閉[9,12-14]。ABA可以提高兜蘭保衛細胞胞質中游離Ca2+([Ca2+]cyt)的濃度，誘導胞質堿化[9]。胞質堿化與胞質Ca2+振蕩在擬南芥保衛細胞ABA與MJ信號轉導中協調發揮作用[15]。胞質堿化也可激活蠶豆保衛細胞外向K+電流，鈍化內向K+電流，從而促進K+凈流出[16]。另外，保衛細胞胞質酸化可介導激動素、吲哚乙酸(IAA)和殼梭孢素(FC)誘導的氣孔開放[9]，并激活內向K+電流[17]。

一氧化氮(NO)作為一種普遍存在于生物體內的胞內和胞間信號分子，參與著多種生理過程[18]。Garcia-Mata等[19]首次證實，NO和氣孔運動有關，外源NO能誘導氣孔關閉；內源NO作為一種中間信號分子，在保衛細胞ABA信號轉導過程中發揮作用[20]。另外，有研究顯示，NO介導水楊酸[21]、暗條件[22]、UV-B[23]等調控的氣孔運動。

目前，尚不清楚Phyto-S1P是否介導其他內、外因素，如暗條件對氣孔關閉的影響，也未見關于Phyto-S1P是否參與暗誘導蠶豆氣孔關閉的報道。為此，本研究借助氣孔試驗，利用基于NO特異熒光探針和pH特異熒光探針的激光共聚焦顯微技術，對Phyto-S1P在暗誘導蠶豆氣孔關閉中的作用及其與保衛細胞胞質堿化和NO產生的關系進行研究，旨在進一步了解Phyto-S1P在暗誘導氣孔關閉中的作用及信號轉導過程，也為完善暗調控氣孔運動的信號轉導途徑積累資料。

1 材料與方法

1.1 試 劑

植物鞘氨醇-1-磷酸(Phyto-S1P)，購自Avanti Polar Lipids 公司；N,N-二甲基鞘氨醇(DMS)，購自Merk(Germany)公司；NO特異熒光探針(DAF-2 DA)、pH特異熒光探針(BCECF-AM)、DL-threo-二氫鞘氨醇(DL-threo-DHS)、NO特異清除劑(cPTIO)、動物一氧化氮合酶(NOS)抑制劑(L-NAME)、2-(N-嗎啡啉)乙烷磺酸(MES)、丁酸、二甲基亞砜(DMSO)，均購自Sigma-Aldrich (St Louis,MO)公司。其余試劑均為國產分析純。

1.2 植物材料處理

蠶豆(ViciafabaL.)種子購自漢中市種子公司。選取籽粒飽滿的蠶豆種子，用質量分數0.1%的HgCl2滅菌10 min，自來水沖洗干凈，于人工氣候箱中催芽，待胚根長至1 cm左右時，播種于盛有濕沙的瓷盤中，于人工氣候箱中培養。人工氣候箱中光源為白色冷熒光燈管(Philips,New York,USA)，培養條件為：相對濕度80%、光強300 μmol/(m2·s)、溫度(25±2) ℃、光/暗周期14 h/10 h。幼苗生長期間每天澆水1次，培養期間無任何水分脅迫。取生長3～4周蠶豆幼苗頂端完全展開的第1，2對葉片，撕取其下表皮，分割成約5 mm×5 mm的表皮條作為試驗材料。

1.3 氣孔開度的測定

氣孔試驗參照McAinsh等[24]的方法并稍作修改。

為研究DL-threo-DHS、DMS、cPTIO和L-NAME對暗誘導氣孔關閉的效應，將新鮮撕取的蠶豆表皮條分別置于MES/KCl緩沖液(10 mmol/L MES/KOH，50 mmol/L KCl，100 μmol/L CaCl2，pH 6.15)中于光下(光強300 μmol/(m2·s)，光處理對照)和暗中處理(暗處理對照)3 h，同時在暗條件下將表皮條分別置于含有15 μmol/L DL-threo-DHS(暗+DL-threo-DHS)、5 μmol/L DMS(暗+DMS)、200 μmol/L cPTIO(暗+cPTIO)和25 μmol/L L-NAME(暗+L-NAME)的MES/KCl緩沖液中，處理3 h，溫度均為(25±2) ℃。

為研究外源Phyto-S1P對氣孔開度的影響，將新鮮撕取的蠶豆表皮條置于含有不同濃度(0，2，4，6和8 μmol/L)Phyto-S1P的MES/KCl緩沖液(組成同前)中于光下處理3 h(對照)；或將Phyto-S1P于光下處理3 h后，再置于不含任何處理試劑的MES/KCl緩沖液中繼續于光下處理3 h(洗脫試驗)，光強均為300 μmol/(m2·s)，溫度為(25±2) ℃。

為研究cPTIO和L-NAME對Phyto-S1P誘導的氣孔關閉的抑制效應，將新鮮撕取的蠶豆表皮條置于MES/KCl緩沖液中(CK)，或置于含有6 μmol/L Phyto-S1P、200 μmol/L cPTIO、25 μmol/LL-NAME及6 μmol/L Phyto-S1P和200 μmol/L cPTIO共處理(P+T)、6 μmol/L Phyto-S1P和25 μmol/LL-NAME共處理(P+L)的MES/KCl緩沖液中，于光下(300 μmol/(m2·s))處理3 h，溫度為(25±2) ℃。

為研究丁酸對Phyto-S1P誘導氣孔關閉的效應，將新鮮撕取的蠶豆表皮條置于MES/KCl緩沖液中，或置于含有6 μmol/L Phyto-S1P、不同濃度(0，0.5，1.0，1.5和 2.0 mmol/L)丁酸及6 μmol/L Phyto-S1P和不同濃度(0，0.5，1.0，1.5和2.0 mmol/L)丁酸共處理的MES/KCl緩沖液中，于光下(300 μmol/(m2·s))處理3 h，溫度為(25±2) ℃。

上述處理結束后，用經臺式測微尺標定的帶目鏡測微尺的光學顯微鏡分別測量氣孔開度。氣孔開度測量在每日的相同時間進行，以避免可能存在的氣孔運動節律對測量結果的影響。每處理至少重復3次，每次隨機測量30個氣孔。試驗數據以90個測量值的“平均值±標準誤”表示。

1.4 保衛細胞NO和胞質pH的檢測

以DAF-2 DA為探針測定保衛細胞NO水平，參照Kojima等[25]的方法并稍加修改。以DMSO(體積分數1%)為溶劑配制10 mmol/L的DAF-2 DA母液，4 ℃保存。以BCECF-AM為探針檢測保衛細胞胞質pH，參照Irving等[9]的方法并稍做修改，以DMSO(體積分數1%)為溶劑配制1 mg/mL的BCECF-AM母液，-20 ℃保存。

為研究DL-threo-DHS、DMS、cPTIO和L-NAME對暗誘導保衛細胞NO生成的影響，以及cPTIO和L-NAME對Phyto-S1P處理引起的保衛細胞NO水平變化的效應，取新鮮撕取的蠶豆表皮條按照1.3節所述方法進行處理；為研究丁酸對暗誘導保衛細胞NO生成的效應，取新鮮撕取的蠶豆表皮條置于MES/KCl緩沖液中，于光下(光強300 μmol/(m2·s)，光處理對照)和暗中(暗處理對照)處理，同時將表皮條置于含有0.5 mmol/L丁酸的MES/KCl緩沖液中于暗中處理(暗+丁酸)，處理溫度均為(25±2) ℃，處理時間均為3 h；為研究丁酸對Phyto-S1P處理引起的保衛細胞NO水平變化的效應，取新鮮撕取的蠶豆表皮條置于MES/KCl緩沖液中(CK)，或置于含有0.5 mmol/L丁酸、6 μmol/L Phyto-S1P及6 μmol/L Phyto-S1P與0.5 mmol/L 丁酸共處理(P+B)的MES/KCl緩沖液中，于光下(300 μmol/(m2·s))處理3 h，溫度為(25±2) ℃；上述處理結束之后立即將表皮條放入含有10 μmol/L DAF-2 DA的Tris-KCl(10 mmol/L Tris、50 mmol/L KCl、pH 7.2)裝載緩沖液中，于(25±2) ℃下避光裝載1 h。

為研究DL-threo-DHS和DMS對暗誘導保衛細胞胞質pH變化的效應，將新鮮撕取的蠶豆表皮條分別置于MES/KCl緩沖液中，于光下(300 μmol/(m2·s))和暗中處理，同時將表皮條置于含有15 μmol/L DL-threo-DHS和5 μmol/L DMS的MES/KCl緩沖液中于暗中處理，處理溫度為(25±2) ℃，處理時間為3 h；為研究丁酸對Phyto-S1P處理引起的保衛細胞胞質pH變化的效應，取新鮮撕取的蠶豆表皮條置于MES/KCl緩沖液中(CK)，或置于含有0.5 mmol/L 丁酸、6 μmol/L Phyto-S1P及6 μmol/L Phyto-S1P和0.5 mmol/L 丁酸共處理(P+B)的MES/KCl緩沖液中于光下處理3 h，溫度為(25±2) ℃；上述處理結束之后立即將表皮條放入含有20 μmol/L BCECF-AM的Tris-KCl裝載緩沖液中，于(25±2) ℃避光裝載10 min。為利于BCECF-AM的裝載，加入質量分數0.05% Pluronic F-127于Tris-KCl 裝載緩沖液中。裝載完成后，用Tris-KCl裝載緩沖液于暗中沖洗掉表皮條表面的多余探針，立即以TCS SP5型激光掃描共聚焦顯微鏡(Leica Lasertechnik Gmbh,Heidelberg)進行檢測。共聚焦顯微鏡的檢測參數設置為：激發波長488 nm，發射波長505～530 nm，常規掃描速度。所得圖像用Leica Image Software和Photoshop 7.0進行分析。

為了檢測Phyto-S1P導致的保衛細胞NO水平和胞質pH變化的時間進程，將新鮮撕取的蠶豆表皮條置于MES/KCl緩沖液中，于光下(光強300 μmol/(m2·s))處理3 h以使氣孔開放，然后立即將表皮條放入含有10 μmol/L DAF-2 DA的Tris-KCl裝載緩沖液中，避光裝載1 h，同時將表皮條放入含有20 μmol/L BCECF-AM和質量分數0.05% Pluronic F-127的Tris-KCl裝載緩沖液中，避光裝載10 min，裝載溫度為(25±2) ℃；以Tris-KCl裝載緩沖液沖洗掉表皮條表面的多余探針后，用Tris-KCl裝載緩沖液孵育表皮條并將 Phyto-S1P(終濃度6 μmol/L)直接加入該緩沖液中，然后用共聚焦顯微鏡(參數同上)檢測30 min內保衛細胞DAF-2 DA和BCECF-AM熒光的變化。

所有樣品的共聚焦圖像均在同一條件(手動設置)下采集。每次處理檢測3個表皮條，每處理至少重復3次。

1.5 統計分析

所有試驗數據用One-way ANOVA進行差異顯著性分析，用Duncan法進行多重比較，以P<0.05 表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 Phyto-S1P誘導保衛細胞NO產生與其介導暗誘導氣孔關閉的關系

She等[22]的研究顯示，保衛細胞NO水平升高為暗誘導氣孔關閉的必需條件。為探明Phyto-S1P是否介導暗誘導蠶豆氣孔關閉，以及暗誘導氣孔關閉期間Phyto-S1P與NO產生是否有關，本研究檢測了DL-threo-DHS和DMS(哺乳動物中LCBK的2種抑制劑)對暗誘導氣孔關閉和保衛細胞NO水平升高的效應。圖1結果顯示，在暗培養條件下，與光處理相比，15 μmol/L DL-threo-DHS和5 μmol/L DMS顯著抑制暗誘導的氣孔關閉(P<0.05)，且與cPTIO、L-NAME的效應相似。與光處理(圖2-A，G)相比，暗處理誘導保衛細胞產生了強烈的DAF-2 DA熒光(圖2-B，G)；而4種試劑均對暗處理DAF-2 DA熒光的產生有一定抑制作用(圖2-C，D，E，F，G)。由DL-threo-DHS和DMS抑制暗誘導氣孔關閉和NO產生的結果可以得出，Phyto-S1P可能通過誘導NO產生介導暗誘導的氣孔關閉。

為進一步證明Phyto-S1P通過誘導NO產生介導暗誘導氣孔關閉，本研究檢測了外源Phyto-S1P對氣孔開度和NO產生的效應。結果顯示，≥4 μmol/L的Phyto-S1P可顯著誘導氣孔關閉(P<0.05)，6 μmol/L為最適濃度；洗脫試驗結果顯示，Phyto-S1P對氣孔開度的效應可以逆轉，而不是由不可逆的細胞毒性引起的(圖3-A)。Phyto-S1P誘導的氣孔關閉和NO產生可被cPTIO和L-NAME顯著阻止(P<0.05)(圖3-B，C)。這些結果進一步證實，Phyto-S1P通過誘導NO產生介導暗誘導氣孔關閉。

圖1 DL-threo-DHS、DMS、cPTIO和L-NAME對暗誘導氣孔關閉的影響

圖2 DL-threo-DHS、DMS、cPTIO和L-NAME對保衛細胞NO產生的影響

2.2 Phyto-S1P提高保衛細胞胞質pH與其參與暗誘導氣孔關閉的關系

要確定Phyto-S1P在暗誘導氣孔關閉中的作用，需研究暗誘導氣孔關閉期間Phyto-S1P與胞質pH變化的關系，本研究首先分析了DL-threo-DHS和DMS對暗誘導胞質pH變化的效應。結果顯示，與光處理(圖4-A，E)相比，暗處理可以顯著提高保衛細胞胞質pH水平(P<0.05)(圖4-B，E)；而暗誘導的保衛細胞胞質pH升高可被15 μmol/L DL-threo-DHS和5 μmol/L DMS顯著抑制(P<0.05)(圖4-C，D，E)。由此可以得出，Phyto-S1P可能通過提高保衛細胞胞質pH水平參與暗誘導氣孔關閉。

為進一步證實暗誘導氣孔關閉中Phyto-S1P的作用及其與保衛細胞胞質pH升高(胞質堿化)的相關關系，本研究檢測了丁酸(常用以調節保衛細胞胞質pH[14])對外源Phyto-S1P誘導氣孔關閉和保衛細胞胞質pH變化的效應。結果顯示，外源Phyto-S1P顯著誘導氣孔關閉(P<0.05)，而≥0.5 mmol/L 丁酸處理對Phyto-S1P誘導的氣孔關閉有顯著抑制效應(P<0.05)(圖4-F)。與對照(CK)相比，Phyto-S1P可顯著誘導保衛細胞胞質堿化 (P<0.05)，而0.5 mmol/L丁酸可顯著抑制Phyto-S1P誘導的胞質pH升高(P<0.05)，且丁酸單獨處理對保衛細胞胞質pH無明顯抑制效應(P>0.05)(圖4-G)。這些結果進一步證實，Phyto-S1P通過誘導保衛細胞胞質堿化參與暗誘導氣孔關閉。

圖3 cPTIO和L-NAME對外源Phyto-S1P誘導的氣孔關閉和保衛細胞NO產生的影響

圖4 Phyto-S1P參與暗誘導氣孔關閉過程中pH的變化

2.3 暗誘導氣孔關閉期間Phyto-S1P誘導的保衛細胞胞質堿化與NO產生的關系

在證實Phyto-S1P通過誘導保衛細胞NO產生和提高胞質pH介導暗誘導氣孔關閉的基礎上，需進一步探明Phyto-S1P誘導的胞質pH升高與NO產生的關系。試驗結果顯示，與光處理相比，暗處理可以顯著誘導NO產生(P<0.05)，而暗誘導NO產生的效應可被丁酸顯著抑制(P<0.05)(圖5-A)。結合前文得到的Phyto-S1P誘導的胞質pH升高和NO產生均參與暗誘導氣孔關閉的結果(圖1,2，3和 4)，可以推斷，暗誘導氣孔關閉期間Phyto-S1P引起的胞質堿化是NO產生的先決條件。

圖5 Phyto-S1P誘導的保衛細胞胞質堿化與NO產生的關系

試驗結果(圖5-B，C)還顯示，對照保衛細胞胞質pH和NO水平在30 min內未見明顯變化；外源Phyto-S1P處理6 min時保衛細胞胞質pH顯著升高(P<0.05)，處理18 min時達到最大值(圖5-B)；而Phyto-S1P處理8 min時NO水平才開始顯著升高(P<0.05)，于處理24 min時達到峰值(圖5-C)。同時，丁酸顯著抑制外源Phyto-S1P誘導的NO產生(P<0.05)(圖5-D)。這些結果進一步證明了暗誘導氣孔關閉中Phyto-S1P誘導的胞質堿化是NO產生的先決條件的推斷。

3 討 論

鞘脂是膜脂的主要成分，鞘脂代謝物S1P和Phyto-S1P是保衛細胞ABA信號轉導途徑中的重要信號分子[3-8]。目前，Phyto-S1P和SPHK已被證明參與ABA調控的擬南芥氣孔運動[5-7]。本研究結果顯示，暗處理可以誘導蠶豆氣孔關閉，外源Phyto-S1P可以模擬暗處理對氣孔開度的影響效應，暗誘導的氣孔關閉可被LCBK抑制劑DL-threo-DHS和DMS顯著抑制。由于LCBK也可以磷酸化鞘氨醇，且S1P也能促進蠶豆和擬南芥氣孔關閉[3-4,8]，故本試驗結果不排除S1P參與暗誘導氣孔關閉的可能性[8]。

已有的研究結果顯示，Phyto-S1P和NO均參與ABA誘導的氣孔關閉[5,7,20,26]。本研究結果顯示，外源Phyto-S1P可以模擬暗效應誘導NO產生。DL-threo-DHS和DMS對暗誘導的NO產生有顯著的抑制效應。這些結果表明，Phyto-S1P通過誘導保衛細胞NO產生介導暗誘導蠶豆氣孔關閉。另外，Phyto-S1P誘導的NO產生可被L-NAME顯著抑制，暗示其類似NOS負責催化Phyto-S1P誘導的氣孔關閉過程中的NO產生。

pH在植物很多生理反應包括氣孔運動中具有重要的信號轉導作用[8,10-11,14]。降低保衛細胞胞質pH的效應劑(如IAA和FC)可促使氣孔開放[9]，而提高保衛細胞胞質pH的效應劑(如ABA和MJ)則促進氣孔關閉[12,16]。前人的研究結果顯示，ABA和MJ誘導的氣孔關閉中，保衛細胞胞質堿化發生于NO產生之前[14,27]。然而，尚不清楚Phyto-S1P是否通過影響胞質pH進而調控氣孔運動。本研究結果顯示，DL-threo-DHS和DMS可顯著抑制暗誘導的保衛細胞胞質pH升高和氣孔關閉，而外源Phyto-S1P可模擬暗處理顯著誘導保衛細胞胞質pH升高和氣孔關閉。此外，Phyto-S1P對胞質pH和氣孔開度的效應可被丁酸顯著抑制。以上結果表明，Phyto-S1P通過引起保衛細胞胞質pH升高(胞質堿化)參與暗誘導蠶豆氣孔關閉。

雖然已經清楚保衛細胞胞質堿化是ABA和MJ誘導NO產生和氣孔關閉中的一個早期事件[14,27]，但尚不清楚暗誘導氣孔關閉中胞質堿化是否為NO產生的誘因。本研究顯示，暗誘導保衛細胞NO產生可被丁酸顯著抑制，結合本研究得到的暗處理顯著誘導保衛細胞胞質堿化、NO產生和氣孔關閉的結果，由此可以推斷，暗誘導氣孔關閉期間保衛細胞胞質堿化是NO產生的誘導因素；而外源Phyto-S1P處理后，胞質pH升高較NO水平增加的滯后期更短且達到峰值更早，且外源Phyto-S1P誘導的保衛細胞NO產生可被丁酸顯著抑制，這些結果進一步證實了該結論。

4 結 論

Phyto-S1P參與了暗誘導蠶豆葉片氣孔關閉的信號轉導過程，且其是通過提高保衛細胞胞質pH和NO水平介導暗誘導的蠶豆氣孔關閉過程，保衛細胞胞質pH升高是NO產生的誘導因素。

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