HIV-1可溶性單鏈抗體b12-scFv的表達與活性分析

楊 雄，劉秀俠，南 昊，許曉東，陳紅英

(西北農林科技大學 生命科學學院，陜西 楊凌 712100)

艾滋病(AIDS)是由人類免疫缺陷病毒(HIV-1)引起的一種病毒性傳染病。自1981年發現以來，該病已經肆虐全球，嚴重危害到人類生命與健康。目前普遍采用聯合使用抗逆轉錄病毒藥物來控制AIDS的進程，延長病人的存活時間，但這些藥物不能徹底清除感染者體內的病毒，而且治療費用昂貴，存在不同程度的副作用。加上HIV-1具有變異率高的特點，為了控制病毒突變體的產生和積累，需要換用不同的藥物，增加了艾滋病治療的成本與難度。因此，迫切需要研制一種安全、有效、廉價并能廣泛使用的HIV-1疫苗，來預防和控制HIV-1的流行[1]。一些具有廣譜中和性作用的抗體的發現、分離及對其相應抗原表位的鑒定，為HIV-1疫苗的研究帶來了新的希望。近年來，人們發現了幾種廣譜中和性抗體，如b12、2F5、4E10、2G12、PG9和PG16，以及最近發現的VRC01、VRC02和VRC03等，能夠識別HIV-1病毒包膜蛋白上相對保守的表位，在體外能有效中和HIV-1病毒各亞型的毒株[2]。這些廣譜中和性單抗的發現為研制可誘導中和性抗體產生的疫苗提供了思路[3]。對這些抗體分子進行深入研究，闡明其識別的HIV-1抗原表位，對于可誘發保護性抗體的抗原表位設計具有重要意義。

b12是第1個被證明具有廣譜中和活性的單抗，它的Fab片段來源于噬菌體展示文庫[4]，為人源化的單抗，其可識別HIV-1 gp120上與CD4受體分子結合部位部分重疊的高度保守的構象依賴型表位[5]。b12可以通過伸出的較長的CDRH3(18aa)環結合HIV-1 gp120的CD4識別位點，阻止HIV-1與靶細胞上受體的結合，表現出病毒中和作用，從而抑制HIV-1的感染。b12可以中和約75%的B亞型的HIV-1分離株[5]，是目前已知的在體內和體外均能特異性結合HIV-1 gp120保守區域的廣譜中和性抗體[6]。

單鏈抗體(Single chain variable fragments，scFv)是一種基因工程抗體，是用一段連接肽將抗體輕鏈可變區(VL區)和重鏈可變區(VH區)連接而成的重組蛋白，它保留了親本抗體的全部抗原結合特異性，連接肽通常使用3次重復的GlyGlyGlyGlySer[(G4S)3]。與完整抗體相比，scFv具有分子質量小、免疫原性低、組織穿透性好、易與靶點結合等優點[7]。Jiang等[8]和Mason等[9]的研究證明，scFv與完整單克隆抗體一樣具有中和病毒的能力。

基因從頭合成技術已經成熟，該技術是目前快速獲得已知基因序列的可靠方法。本研究根據文獻[10]報道的b12抗體的輕鏈和重鏈氨基酸序列，依照大腸桿菌密碼子偏愛性，將氨基酸序列轉換、優化成DNA序列，再設計2對引物Ncob12L-F、G4SLight-R和G4SH-F、XhoH-R，分別擴增其輕鏈和重鏈可變區基因，然后用引物Ncob12L-F和XhoH-R通過重疊PCR的方法將二者人為拼接起來，并克隆到原核表達載體上，在大腸桿菌中誘導表達，并用Ni-NTA金屬螯合層析柱的方法從大腸桿菌細胞破碎液的上清中純化獲得了可溶性的b12單鏈抗體，檢測其與HIV-1 gp120的結合活性，以期為深入研究b12單鏈抗體與HIV-1抗原分子的相互作用及設計新型有效的HIV-1疫苗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株與質粒 原核表達載體pET28a、大腸桿菌(Escherichiacoli) Top10、大腸桿菌BL21 StarTM(DE3)來自Novagen公司。Sf9細胞來自Invitrogen公司。b12抗體輕鏈和重鏈全基因由上海旭冠生物科技發展有限公司合成。

1.1.2 工具酶及生化試劑Pfu高保真DNA聚合酶、dNTPs、限制性內切酶NcoⅠ和XhoⅠ， 均購自Fermentas公司；T4 DNA連接酶和SDS-PAGE電泳標準蛋白，為Takara公司產品；凝膠回收試劑盒、PCR產物純化試劑盒和質粒DNA小量抽提試劑盒、ELISA顯色試劑盒，均購自生工生物工程(上海)有限公司；Ni-NTA金屬螯合層析柱，購自Merck公司；抗組氨酸(His)標簽鼠單克隆抗體、HRP和FITC標記的山羊抗鼠IgG，購自康為世紀生物公司；PVDF膜，購自Millipore公司；DNA Marker，購自Biomed公司。

1.2 方 法

1.2.1b12-scFv基因片段的合成 依據b12的輕鏈及重鏈基因序列，設計2對引物，交由生工生物工程(上海)有限公司合成。輕鏈上游引物Ncob12L-F：5′-TTGTCCATGGAGATCGTGCTGACCCAATC-3′，5′端下劃線部分為引入的NcoⅠ酶切位點；下游引物G4SLight-R：5′-GCTCCCGCCACCTCCAGA-GCCTCCGCCACCAGATGGTGCGGCCAC-3′。重鏈上游引物G4SH-F：5′-GGAGGTGGCGGGAGCGGCGGTGGAGGGTCTCAGGTGCAGCT-GGTGCAG-3′；下游引物XhoH-R：5′-TTGTCTCGAGAGAGGCGCTGCTCACGATCAC-3′，5′端下劃線部分為引入的XhoⅠ酶切位點。分別用對應引物從合成的輕鏈與重鏈基因上擴增出其可變區基因片段，通過G4SLight-R和G4SH-F引物在輕鏈和重鏈之間引入編碼(G4S)3間隔序列基因(Linker)，最后通過重疊PCR的方法拼接得到完整的b12-scFv基因序列。PCR反應體系為20 μL，內含2 μL 10×Buffer，2 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L dNTP，上、下游引物各0.2 μmol/L，模板DNA 20 ng和1 U的Pfu高保真DNA聚合酶。PCR擴增輕鏈和重鏈可變區的反應條件為:94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，46 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，30個循環；最后72 ℃延伸10 min。重疊PCR擴增單鏈抗體全長基因時，延伸時間為90 s，其他反應條件與可變區片段的擴增條件相同。PCR產物用試劑盒純化后，用限制性內切酶NcoⅠ(10 U/μL)和XhoⅠ(10 U/μL)進行雙酶切，酶切體系為50 μL，其中10×Buffer R 5 μL、PCR產物25 μL、NcoⅠ 0.5 μL、XhoⅠ 0.5 μL、雙蒸水19 μL，混勻后于37 ℃水浴酶切4 h。取全部酶切產物進行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，按照凝膠回收試劑盒說明書回收目的基因片段，即得b12-scFv基因，其結構表示為：scFv-VL-Linker-VH。

1.2.2 重組質粒pETb12-scFv的構建 用限制性內切酶NcoⅠ(10 U/μL)和XhoⅠ(10 U/μL)對載體pET28a進行雙酶切，電泳回收大片段。將b12-scFv基因片段與載體pET28a大片段按照物質的量比約為3∶1混合，在T4 DNA連接酶的作用下16 ℃過夜連接。用1 μL的連接產物轉化大腸桿菌Top10感受態細胞，在含有50 μg/mL卡那霉素的LB固體培養基中于37 ℃培養過夜。挑取單菌落進行菌落PCR鑒定。將鑒定結果為陽性的菌落接種到含有50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養基中過夜培養，按照質粒DNA小量抽提試劑盒說明書提取質粒，進行NcoⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定，酶切產物進行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，同時對質粒進行測序，測序由生工生物工程(上海)有限公司完成。將測序結果與設計的DNA序列進行比對分析。將獲得的陽性重組質粒命名為pETb12-scFv。

1.2.3 重組b12-scFv蛋白的誘導表達 將重組質粒pETb12-scFv轉化至大腸桿菌BL21 StarTM(DE3)原核表達宿主感受態細胞中，將轉化產物涂布于含50 μg/mL卡那霉素的LB固體培養基中于37 ℃培養過夜，挑取陽性克隆至含50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養基中，37 ℃、250 r/min培養過夜。將過夜菌液按體積比1∶50轉接入含50 μg/mL 卡那霉素的LB液體培養基，擴大培養，37 ℃、250 r/min條件下培養至菌液OD600=0.6～1.0(大約需要2.5 h)，留取部分菌液做未誘導對照，其余菌液加入IPTG使其終濃度為0.5 mmol/L，在室溫下誘導4 h。誘導表達后將菌液于4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，收集菌體，用PBS (pH 7.4) 緩沖液懸浮。

用超聲破碎儀在冰浴條件下破碎懸浮菌體，超聲功率為30 W，超聲時間5 s，間隔時間5 s，破碎10 min。超聲破碎后，將裂解的菌液于4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，分別收集上清液和沉淀(沉淀用1/6 上清液體積的PBS緩沖液重懸)，加入2×蛋白上樣緩沖液，進行100 g/L SDS-PAGE電泳，檢測蛋白表達及分布情況。

1.2.4 重組b12-scFv蛋白的親和純化 取1 mL固化Ni-NTA樹脂裝入層析柱中，樹脂沉降后的體積定義為1個柱床體積。用3倍柱床體積的無菌水沖洗樹脂，再加3倍柱床體積的結合緩沖液(20 mmol/L磷酸鈉，500 mmol/L氯化鈉，pH 7.8)平衡樹脂，然后將超聲波處理的細胞裂解液上清上柱，依次用6倍柱床體積的結合緩沖液、4倍柱床體積的洗滌緩沖液(20 mmol/L磷酸鈉，500 mmol/L氯化鈉，pH 6.0)分別洗柱，最后用50，100，200和300 mmol/L咪唑洗脫緩沖液洗脫結合蛋白，分步收集，每個濃度梯度收集約1.5 mL。將純化獲得的蛋白做梯度稀釋后，與已知濃度的蛋白分子質量標準對比估測濃度，計算純化蛋白的產量。

1.2.5 重組b12-scFv蛋白與HIV-1 gp120結合活性的ELISA檢測 真核分泌表達的HIV-1 gp120蛋白的制備方法如文獻[11]所述。用包被緩沖液(0.05 mol/L Na2CO3，0.05 mol/L NaHCO3，pH 9.6)稀釋HIV-1 gp120蛋白(稀釋度1∶10)，將稀釋的HIV-1 gp120蛋白溶液加入96孔酶標板中，每孔100 μL，4 ℃包被過夜。TBST(含1 mL/L Tween-20的TBS)洗板3次，每次5 min；每孔加入100 μL含50 g/L脫脂奶粉的TBST,于37 ℃封閉2 h，TBST洗板3次，每次5 min；每孔加入100 μL 2倍倍比稀釋(從1/2，1/4，1/8，1/16，1/32，1/64，1/128，1/256，總共8個質量濃度梯度，初始蛋白質量濃度為250 μg/mL)的待測b12-scFv，每個稀釋度做2個復孔，37 ℃孵育2 h，同時設立不加單鏈抗體的陰性對照，TBST洗板3次，每次5 min。然后加入100 μL抗組氨酸(His)標簽鼠單克隆抗體(稀釋度1∶1 000)，室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，每次5 min；再加入100 μL HRP標記的山羊抗鼠IgG(稀釋度1∶2 000)，室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，每次5 min。最后加入TMB顯色底物，顯色5 min后，加2 mol/L H2SO4終止顯色，450 nm測定吸光值(OD450)。

1.2.6 重組b12-scFv蛋白與HIV-1 gp120結合活性的熒光顯微鏡觀察和流式細胞儀(FCM)檢測 細胞表面錨定表達有HIV-1 gp120的Sf9細胞的獲得方法參見文獻[12]，以不表達HIV-1 gp120的Sf9細胞作為陰性對照。1 000 r/min離心15 min收集細胞，用重組b12-scFv蛋白(稀釋度1∶50)室溫孵育1 h，PBS洗3次，每次5 min；然后加入抗組氨酸(His)標簽鼠單克隆抗體(稀釋度1∶200)，室溫孵育2 h，PBS洗3次，每次5 min；再加入FITC標記的山羊抗鼠IgG(稀釋度1∶100)，室溫孵育2 h，PBS洗3次，每次5 min；最后加入40 g/L多聚甲醛固定10 min后，1 000 r/min離心15 min收集沉淀，用PBS (pH 7.4) 緩沖液懸浮，在熒光顯微鏡下觀察。

流式細胞分析使用CyFlow?Cube 6型流式細胞儀，激發波長488 nm，綠色熒光信號在FL1通道檢測(發射波長530 nm)，收集數據使用CyView 8.5 軟件。每個樣品至少使用4×104個細胞收集數據，離線數據分析用FCS Express 4軟件。

2 結果與分析

2.1 b12-scFv基因的合成

PCR擴增獲得的輕鏈和重鏈基因片段經瓊脂糖凝膠電泳后，得到約400 bp的特異性條帶(圖1-A，B)，片段長度與預期結果相符。重疊PCR產物的電泳檢測結果發現，PCR產物有非特異擴增條帶和拖尾現象，但最主要的擴增條帶長約768 bp(圖1-C)，與預期的b12-scFv基因全長相符。

圖1 b12-scFv基因的PCR擴增

2.2 重組質粒pETb12-scFv的鑒定

重組質粒經NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切后，經10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳，可檢測到除載體片段外，還有1條約800 bp的插入片段(圖2)，長度與預期相符，表明目的基因已成功插入表達載體中。測序結果證實，pETb12-scFv的大小、讀碼框均正確，表明克隆得到了正確的重組質粒。

2.3 b12-scFv的誘導表達及SDS-PAGE分析

用重組質粒pETb12-scFv轉化BL21 StarTM(DE3)菌，經IPTG誘導表達4 h后，超聲破碎，100 g/L SDS-PAGE電泳分析，結果(圖3)表明，破碎全菌、破碎上清液和沉淀均出現1條分子質量約為29 ku的條帶，其大小與b12-scFv蛋白理論值相符，而未誘導對照則沒有該條帶，表明目的蛋白得到了表達，且表達產物大部分在上清液中，以可溶性蛋白形式存在，也有少部分以包涵體的形式存在。

圖2 重組質粒pETb12-scFv的NcoⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定

2.4 b12-scFv蛋白的親和純化

采用Ni-NTA親和柱純化上清液中的可溶性蛋白，依次用50，100， 200和300 mmol/L咪唑洗脫緩沖液洗脫結合蛋白，分步收集，取部分洗脫蛋白樣品加入2×蛋白上樣緩沖液，100 g/L SDS-PAGE電泳分析，結果(圖4)顯示，大量目的蛋白存在于200和300 mmol/L咪唑洗脫組分中。將這2個洗脫組分合并，從300 mL培養液菌體中純化獲得了總體積為3 mL的b12-scFv蛋白；取純化蛋白小樣進行梯度稀釋，與已知濃度的蛋白標準對比，估測其質量濃度約為0.2 mg/mL。通過計算得出純化蛋白的產量約為2 mg/L。

圖4 單鏈抗體b12-scFv表達產物的純化

2.5 b12-scFv與HIV-1 gp120結合活性的ELISA檢測

ELISA檢測結果(圖5)表明，當b12-scFv的稀釋度達到1/64，即蛋白質量濃度約為4 μg/mL時，其OD450數值仍為陰性對照的2.1倍以上，可以認為其為陽性， 表明b12-scFv與HIV-1 gp120具有較強的結合活性。

圖5 b12-scFv與HIV-1 gp120結合活性的ELISA檢測

2.6 b12-scFv與HIV-1 gp120蛋白結合活性的熒光觀察及流式細胞儀檢測

在熒光顯微鏡下可觀察到，表達HIV-1 gp120的細胞表面發綠色熒光(圖6-A，B)。FCM檢測結果顯示，表達HIV-1 gp120的細胞熒光強度明顯高于不表達HIV-1 gp120的對照細胞(圖6-C)，說明b12-scFv可以特異性地識別細胞膜表面的HIV-1 gp120。

圖6 b12-scFv與細胞膜表面表達的HIV-1 gp120蛋白結合活性的檢測

3 討 論

用原核表達系統表達蛋白具有成本低、表達效率高等特點[12]，scFv一般都采用原核表達系統獲得。盡管大腸桿菌不能進行糖基化修飾，但這對scFv的表達沒有影響，因為scFv沒有抗體穩定區，不需要糖基化來獲得生物學活性。但是由于scFv是將抗體輕鏈和重鏈可變區人為拼接獲得的重組蛋白，在高效的原核表達系統中往往以不溶性的包涵體形式存在，需要在變性劑存在的條件下溶解、純化，然后經復性才能得到可溶性的具有抗原結合能力的單鏈抗體蛋白，而經過變性、復性過程獲得的單鏈抗體一般產量較低，活性也會受到影響。已有的文獻報道，b12的scFv也是從包涵體中經溶解、純化和復性獲得的[13]。本研究采用化學合成的方法獲得了b12抗體重鏈和輕鏈的基因序列，用重疊PCR的方法拼接得到了b12-scFv基因，利用原核表達系統，在室溫和IPTG終濃度為0.5 mmol/L的條件下，誘導表達的b12-scFv主要以可溶性蛋白的形式存在，從1 L培養液中能純化獲得大約2 mg可溶性蛋白。純化的蛋白具有良好的HIV-1 gp120結合活性。降低誘導溫度與IPTG的濃度，延長表達時間，可能有助于增加可溶性蛋白的產量，最佳的表達條件有待于進一步研究。

本研究中報道的b12單鏈抗體可溶性較好，表達量較高，純化過程簡單，抗原結合能力好。用基因工程的方法在體外大量制備該抗體，可用于艾滋病的被動免疫防治[14]；在基于包膜蛋白的HIV-1重組疫苗的設計中，可用于b12抗原表位的檢測，在HIV-1的被動免疫治療和免疫原檢測中具有一定的應用前景。

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