牡丹試管苗與扦插苗生根過程中相關酶活性的變化

王 政，王照路，申 萍，王雪玲，何松林

(河南農業大學 林學院，河南 鄭州 450002)

牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)別名木芍藥、富貴花、鼠姑,為芍藥科芍藥屬宿根木本花卉，是我國著名的觀賞植物與藥用植物[1]。其野生種主要分布于陜西、河南、四川、西藏等地，花姿典雅，雍容華貴，被譽為“花中之王”，是我國的傳統名花，常采用播種、分株和嫁接等傳統方法繁殖。但在實際生產中，傳統繁殖方法的繁殖系數低，生長速度慢，難以滿足牡丹苗木產業化和商品化生產的需要。而組織培養技術能大大縮短牡丹的繁殖周期，繁殖系數高，利于大規模生產。但牡丹試管苗根系發生困難、根系質量不高成為生根培養的主要瓶頸之一[2]。

無根試管苗與扦插苗生根過程相似，在其不定根的形成過程中，均伴隨著插穗或試管苗莖基部組織進行細胞脫分化、根原基形成以及酶活性變化等一系列生理活動。有研究表明，牡丹試管苗由于根系由基部愈傷組織形成且無維管束與莖中木質部連接，導致其根系質量不高且成活率低[3]；扦插苗不定根中的維管束與插穗木質部直接相連，根系質量好且移栽成活率較高。因此，研究牡丹試管苗和扦插苗生根過程中生理指標的變化規律具有重要意義。研究表明，過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)和吲哚乙酸氧化酶(IAAO)等酶活性的變化與植物生根過程密切相關。PPO對蘋果[4-5]、梨[5]插穗和葡萄[6]試管苗生根有影響；POD與樂昌含笑[7]試管苗生根過程中根原基的形成和發育密切相關，與垂絲海棠、楸子[8]插穗生根過程中愈傷組織的形成有關；在山杏[9]插穗生根過程中IAAO活性與不定根的形成有關。目前，有關牡丹生根過程中POD、PPO、IAAO等酶活性的研究，主要集中在試管苗生根過程中的變化規律[2-3,10-11]方面，而對扦插苗和試管苗生根前后酶活性變化情況的研究尚未見報道。因此，本試驗擬通過對比大田扦插苗和組培試管苗生根過程中上述3種酶活性的變化規律，探討酶活性變化與牡丹生根的關系，分析牡丹試管苗生根難的可能內在原因，以期為提高牡丹試管苗生根率提供理論基礎和技術依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

于2013-01-25，在洛陽土橋花木種苗有限公司牡丹苗木基地采集牡丹品種‘鳳丹白’鱗芽，取樣植株生長狀況良好，無病蟲害，常規田間管理。將所采牡丹鱗芽滅菌后接種到含MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L (pH=5.8)的固體培養基上，在常規條件下[溫度(24±1) ℃，光照強度40 μmol/(m2·s)，光照時間12 h/d]進行誘導培養，培養30 d后獲得供試試管苗。

牡丹品種‘鳳丹白’插穗采自河南農業大學三區實驗基地，母株為3年齡。插穗為當年生半木質化嫩枝，長10～12 cm，基部直徑0.5～0.8 cm。每條插穗留2～3個芽，剪去下部葉片，將插穗下端剪成平滑的斜面，上端留2～3片葉片，并剪去葉片的 1/3 以減少蒸騰，備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 組織培養誘導生根 將供試牡丹試管苗在超凈工作臺上，接種到含木本植物培養基(WPM)+IBA 4.0 mg/L+聚乙烯吡咯烷酮(PVP)1.0 g/L+Vc 50 mg/L+植物凝膠(Gellan gum)2.0 g/L+蔗糖30 g/L (pH=5.8)的固體培養基中，進行生根培養，每瓶接種1株。

1.2.2 扦插生根 將修剪好的牡丹插穗用1 g/L IBA處理，然后扦插在V(沙)∶V(土)=1∶1的混合基質中，置于盆中培養，插入深度為插穗長的1/2～2/3，壓實基質，澆透水，之后保持濕潤。

1.3 測定指標及方法

賀丹等[3]、徐盼盼[10]對牡丹試管苗生根過程的觀察發現，其生根時間為誘導培養后3～15 d；本研究預試驗發現，牡丹扦插苗在第18天有根原基形成，因此將試驗取材時間定為0～21 d。于生根培養的0，1，2，3，4，5，7，9，12，15，18，21 d取材，試管苗隨機取10株，取其莖基部；扦插苗隨機取10株，取插穗基部1～2 cm；各自混勻后分別測定其POD、PPO、IAAO酶活性，均重復3次。

POD活性測定參照李合生[12]的方法；PPO活性測定參照朱廣廉等[13]的方法；IAAO活性測定參照張志良[14]的方法。

1.4 數據統計與分析

試驗數據采用Excel軟件和DPS 3.01對數據進行處理分析；采用鄧肯氏新復極差法(SSR法)檢測其差異顯著性，顯著水平為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 試管苗與扦插苗生根過程中過氧化物酶(POD)活性的變化

從圖1可以看出，生根過程中，牡丹試管苗的POD活性在0～3 d整體呈下降趨勢，其中第3天降到最低值(6.67 U/g)；在3～7 d呈上升趨勢，并在5 d達到第1峰值，然后在第9天下降至18.67 U/g；9～12 d急劇上升，于第12天達到第2峰值，12～15 d下降，而后呈上升趨勢；且試管苗的POD活性始終顯著高于扦插苗。與試管苗相比，扦插苗的POD活性變化趨勢較平緩，其中0～2 d呈上升趨勢，第3天下降至1.67 U/g，第4天上升至最大值(20.00 U/g)后下降，在5～15 d整體呈上升趨勢，于第15天達到第2峰值后下降，在18～21 d又呈上升趨勢。試管苗與扦插苗POD活性均在第3天降到最低值，第1個峰值出現時間分別為5和4 d，分別于12和15 d達到第2個峰值；第2個低值出現時間分別是第9和第5天。

圖1 牡丹試管苗和扦插苗生根過程中過氧化物酶(POD)活性的變化

2.2 試管苗與扦插苗生根過程中多酚氧化酶(PPO)活性的變化

在本試驗中，牡丹品種‘鳳丹白’無根試管苗與扦插苗生根過程中多酚氧化酶(PPO)活性的變化結果見圖2。

如圖2所示，轉入生根培養基后，牡丹試管苗的PPO活性在0～1 d迅速上升，在第1天達到最高峰(21.0 U/g)，1～5 d整體呈下降趨勢，于第5天降到最低值(1.0 U/g)，5～12 d呈波浪上升趨勢，于第12天達到峰值后下降，18～21 d再次上升；扦插苗的PPO活性在0～3 d上升后下降，于第4天降到1.0 U/g，4～9 d逐步上升，第9天出現第2個峰值，9～15 d下降后再次上升，于第21天達到最大值(7.0 U/g)。整個生根過程中試管苗與扦插苗PPO活性在第1，2和12天差異顯著。與試管苗相比，扦插苗PPO活性第1個峰值的出現時間推遲2 d，第2個峰值提前3 d；試管苗與扦插苗PPO活性分別在5和4 d降到最低值。

2.3 試管苗與扦插苗生根過程中吲哚乙酸氧化酶(IAAO)活性的變化

由圖3可知，在生根培養過程中，試管苗IAAO活性變化較小，在0～7 d呈波浪上升趨勢，在第7天達到峰值(33.47 U/g)后下降并趨于平穩，18～21 d上升，于第21天達到最大值(36.59 U/g)；扦插苗在0～5 d呈下降趨勢，第5天降至27.82 U/g，然后上升，于第9天達到第1個峰值(50.04 U/g)，9～15 d下降，于第15天降到最低值(27.23 U/g)，15～21 d迅速上升，第21天達到最大值(67.39 U/g)。在生根過程中，除第4天外，二者IAAO活性均達顯著差異，扦插苗IAAO活性變化幅度較試管苗大。試管苗與扦插苗IAAO活性分別在第7和第9天出現第1個峰值，試管苗較扦插苗提前2 d，二者均在21 d達到最大值；試管苗在第3天出現低值，扦插苗在第5天出現低值，第15天降到最低。

圖3 牡丹試管苗和扦插苗生根過程中吲哚乙酸氧化酶(IAAO)活性的變化

3 結論與討論

本試驗探討了牡丹品種‘鳳丹白’試管苗與扦插苗生根過程中POD、PPO、IAAO 3種酶活性的變化，結果表明，在生根過程中，牡丹試管苗POD活性呈“下降-上升-下降-上升”的趨勢，PPO和IAAO活性均呈“上升-下降-上升”趨勢；而扦插苗POD和PPO活性均呈“上升-下降-上升”趨勢，IAAO活性呈“下降-上升-下降-上升”趨勢；牡丹試管苗POD活性在第3天降到最低值，第1個峰值出現時間較扦插苗推遲1 d；PPO活性第1個峰值較扦插苗提前2 d，最低值推遲1 d；IAAO活性第1個峰值出現時間較扦插苗提前2 d，均在第21天達到最大值，第1個低值出現時間較扦插苗提前2 d。

近年來，有研究認為，POD、PPO及IAAO活性與植物不定根的發生和生長均有著密切關系，其變化因生根時期不同而異[15]。相關研究表明,在不定根誘導期和表達期,POD 活性升高是有生根能力的標志[16-17]。賀丹等[3,11]、徐盼盼[10]對牡丹試管苗進行生根細胞學觀察發現，根原基的誘導發生于3～5 d，9～15 d根原基進一步分化，逐漸突破表皮。本試驗發現，牡丹試管苗POD活性在生根培養的3～5 d迅速上升后下降，9～12 d繼續上升。由此推測，第3天開始POD活性升高，可能是因為產生了某些物質進而促進了試管苗不定根的發生，9～12 d POD活性迅速升高有利于根原基的進一步分化；15～21 d POD活性繼續升高，可能與莖基部木質素的成熟度有關[18]；扦插苗POD活性變化較平緩， 3～4 d上升達最大值后下降，5～15 d整體呈上升趨勢，于第15天達到峰值后下降，18～21 d再次升高，這與宋金耀等[19]的研究結果類似，可能起始期高活性的POD對不定根的發生起誘導作用。在生根過程中，試管苗與扦插苗POD活性均在第3天降到最低值，而后呈上升趨勢，可能有利于根原基的誘導。試管苗POD活性第2個峰值出現在第12天，而扦插苗出現在第15天，較試管苗推遲3 d，可能與扦插苗根系發生較晚有關。

PPO是一種含銅酶，可能會催化酚類物質與IAA形成一種“IAA-酚酸復合物”，這種復合物可能是一種生根輔助因子，可促進不定根的形成[17]。另外，PPO活性還與植物組織培養外植體褐變有密切關系，接種時由于切割作用，PPO作用于天然底物酚類物質而形成褐色物質醌，導致外植體的褐化，直接影響組培苗生根及正常生長[6,20]，因此，PPO對生根具有雙重效應。本試驗中，試管苗0～2 d PPO活性變化劇烈，第1天達到最大值，可能是由于切割作用，PPO催化多酚類物質發生褐化，導致PPO活性迅速升高，2～12 d呈波浪上升趨勢，可能有利于“IAA-酚酸復合物”的形成以促進根原基的誘導；扦插苗PPO活性在0～3 d上升后下降，從第4天開始繼續上升，于第9天達到峰值，可能有利于根原基的誘導，在15～21 d逐步升高，于第21天達到最大值，可能是因為催化生成的“IAA-酚酸復合物”增多，從而促進根的形成。在整個生根過程中，與試管苗相比，扦插苗PPO活性第1個峰值出現的時間推遲2 d，第2個峰值提前3 d，2個峰值均低于試管苗，第21天扦插苗PPO活性達到最大值且較試管苗高，可能與扦插苗根系發生較試管苗晚有關。

IAAO可以降解植物體內的吲哚乙酸(IAA)，調節植物體內的IAA水平，從而影響試管苗生根[21-22]。Gaspar等[23]試驗表明，離體生根過程中，高活性的IAAO使內源IAA水平降低，是生根誘導期的特點之一。低濃度的IAA有利于誘導生根，之后在表達期要求較高濃度的IAA以促進根的生長。本試驗中，試管苗IAAO活性變化不顯著，在0～7 d呈波浪上升式變化，第7天出現峰值，可能有利于降低內源IAA水平從而促進根原基的誘導，之后變化趨于平緩，于第21天達到最大值，可能與本研究觀察到該時期的側根形成現象有關。扦插苗IAAO活性在0～5 d下降，5～9 d呈上升趨勢，第9天出現第1個峰值。有研究表明，扦插后前10 d是根的誘導階段[24]，期間IAAO活性升高可能會促進IAA分解，有利于根原基誘導生根；9～15 d逐漸下降至最低值，可能有利于愈傷組織的形成，隨后迅速上升，第21天達到最大值，其變化趨勢與宋金耀等[19]研究的月季、葡萄等植物在扦插生根過程中IAAO活性的變化趨勢相似。在生根過程中，除第4、5和15天外，扦插苗IAAO活性均較試管苗高，且扦插苗IAAO活性第1個峰值和低值的出現時間均較試管苗推遲2 d，可能是扦插苗根系發生晚的原因之一。扦插苗IAAO活性變化幅度較大，在根的誘導階段(扦插后0～10 d)先下降后迅速上升，有利于降低內源IAA水平，從而促進根原基的誘導；而試管苗IAAO活性則變化較平緩，可能在調節內源IAA水平方面作用不顯著。

本研究發現，與試管苗相比，牡丹扦插苗生根過程中POD、PPO及IAAO酶活性的一些極值出現時間均出現推遲現象，這與扦插苗生根時間較晚有關，但其作用機理還有待于進一步研究。

[參考文獻]

[1] 包滿珠．花卉學 [M].2版.北京：中國農業出版社，2003:215.

Bao M Z.Floriculture [M].2nd ed.Beijing:China Agriculture Press,2003：215.(in Chinese)

[2] 李 航，王永偉，何松林．牡丹試管苗生根研究進展和展望 [J].安徽農業科學，2007,35(12):3499-3513.

Li H,Wang Y W,He S L.Research progress and prospect of root-inducing ofPaeoniasuffruticosa[J].Journal of Anhui Agri Sci,2007,35(12):3499-3513.(in Chinese)

[3] 賀 丹，王 政，何松林．牡丹試管苗生根過程解剖結構觀察及相關激素與酶變化的研究 [J].園藝學報，2011,38(4):770-776.

He D,Wang Z,He S L.Adventitious root generating process and hormone and enzyme changesinvitroPaeoniasuffruticosa[J].Acta Horticulturae Sinica,2011，38(4)：770-776.(in Chinese)

[4] Bassuk N L，Hunter L D，Howard B H．The apparent involvement of polyphenol oxidese and phloridzin in the production of apple rooting cofactors [J].Hortic Sci,1981,56：313-315．

[5] Poapst P A,Durkee A B.Root differentiating properties of so-me simple aromatic substances of the apple and pear fruit [J].J Hort Sci,1967,42:429-438.

[6] 宋士任，王 華．葡萄多酚含量和多酚氧化酶(PPO)活性與組培苗生根關系的初步研究 [J].中國農學通報，2005,21(9):70-73.

Song S R,Wang H.The effect of polyphenol content and polyphenol oxidase activity on rooting of tissue cultured seedlings inVitisL. [J].Chinese Agricultural Science Bulletin,2005,21(9):70-73.(in Chinese)

[7] 吳秋峰，金 玲，吳月燕．樂昌含笑組織培養根的誘導及其POD和PPO活性的變化 [J].科技通報，2009,25(4):460-464.

Wu Q F,Jin L,Wu Y Y.Activity changes of POD and PPO during root inducing in tissue culture ofMicheliachapensisDandy [J].Bulletin of Science and Technology,2009,25(4):460-464.(in Chinese)

[8] 許曉崗，丁芳芳，童麗麗．垂絲海棠、楸子扦插生根的生理機制 [J].東北林業大學學報，2013,41(5):91-97.

Xu X G,Ding F F,Tong L L.Basic physiological indices in cuttings ofMalushallianaandMalusprunifolia[J].Journal of Northeast Forestry University,2013,41(5):91-97.(in Chinese)

[9] 董勝君，劉明國，戴 菲，等．2種激素處理的山杏插穗生根過程中營養物質及酶活性的變化 [J].西部林業科學，2012,41(6):26-30.

Dong S J,Liu M G,Dai F,et al.Variation of nutrients and enzyme activities inArmeniacasibiricasoftwood cuttings during adventitious root formation under treatments of two hormones [J].Journal of West China Forestry Science,2012,41(6):26-30.(in Chinese)

[10] 徐盼盼．環境因子對牡丹試管苗生根的影響 [D].鄭州：河南農業大學，2011.

Xu P P.The effect of environmental factor on rooting culture ofPaeoniasuffruticosainvitro[D].Zhengzhou:Henan Agricultural University,2011.(in Chinese)

[11] 賀 丹．牡丹試管苗生根調控研究 [D].鄭州：河南農業大學,2009.

He D.The control on rooting culture ofPaeoniasuffruticosainvitro[D].Zhengzhou:Henan Agricultural University,2009.(in Chinese)

[12] 李合生．植物生理生化實驗原理和技術 [M].北京：高等教育出版社，2003:164-165.

Li H S.Principle and technique of plant physiological and biochemical experiment [M].Beijing:Higher Education Press,2003:164-165.(in Chinese)

[13] 朱廣廉，鐘海文，張愛琴．植物生理實驗 [M].北京:北京大學出版社，1990:37-39.

Zhu G L,Zhong H W,Zhang A Q.Principle of plant physiological experiment [M].Beijing:Beijing University Press,1990:37-39.(in Chinese)

[14] 張志良．植物生理學實驗指導 [M].2版.北京：高等教育出版社，1990．

Zhang Z L.Principle of plant physiological experiment guidance [M].2nd ed.Beijing:Higher Education Press,1990.(in Chinese)

[15] 扈紅軍，曹幫華，尹偉倫，等．不同處理對歐榛硬枝扦插生根的影響及生根過程中相關氧化酶活性的變化 [J].林業科學，2007,43(12):70-75．

Hu H J,Cao B H,Yin W L,et al.Effects of different treatments on hardwood-cutting rooting and related oxidase activity changes during rooting ofCorylusavellana[J].Scientia Silvae Sinicae,2007,43(12)：70-75.(in Chinese)

[16] Moncousin C,Gaspar T H.Peroxidase as a marker for rooting improvement ofCynarascolymusL.culivatedinvitro[J].Biochemie und Physiologieder Pflanzen,1983,178:263-271.

[17] Haissig B E.Influence of auxins and auxin synergists on adventitious root primordium initiation and development [J].NZ J For Sci,1974,4:311-323.

[18] Conzalez A,Tames S R,Rodriguez R.Ethylene in relation to protein,peroxidase and polyphenol oxidase activities during rooting inhazelnut cotyledons [J].Physiol Plant,1991,83:611-620.

[19] 宋金耀，宋 剛，李 輝，等．幾種園藝植物扦插生根過程中生化指標的變化 [J].江蘇農業科學，2010(3):211-214．

Song J Y,Song G,Li H,et al.The changes of several horticultural plants physiological index during rooting process [J].Journal of Jiangsu Agri Sci,2010(3):211-214.(in Chinese)

[20] 崔堂兵，郭 勇，張長遠．植物組織培養中褐變現象的產生機理及克服方法 [J].廣東農業科學，2001(3):16-18.

Cui T B,Guo Y,Zhang C Y.Occurring mechanism and overcoming ways of browning in plant tissue culture [J].Journal of Guangdong Agri Sci,2001(3):16-18.(in Chinese)

[21] Jackson M B.New root formation in plant and cuttings [M].Lancaster:Martinus Nijhoff Publishers,1986:223-253.

[22] Gebhardt K.Activation of indole-3-acetic acid oxidase from ho-rseradish andPrunusby phenols and H2O2[J].Plant Growth Reg,1982,1:73-84.

[23] Gaspar T,Kevers C,Hausman J F,et al.Practical uses of peroxidase activity as a predictive marker of rooting performance of micropropagated shoot [J].Agronomic,1992(12)：757-765.

[24] 宋麗紅，曹幫華．光葉楮扦插生根的吲哚乙酸氧化酶、多酚氧化酶、過氧化物酶活性變化研究 [J].武漢植物學研究，2005,23(4):347-350.

Song L H,Cao B H.Studies on activities of indoleacetic acid oxidase,polyphenol oxidase and peroxidase in cuttings ofBroussonetiapapyriferaduring rooting process [J].Journal of Wuhan Botanical Research,2005,23(4):347-350.(in Chinese)