熱毒寧對呼吸道合胞病毒感染哮喘模型小鼠的影響*

盧協勤，杜強，高天明，張揚，翁曉琴，馮旰珠**

南京醫科大學第二附屬醫院1藥劑科；2呼吸科，江蘇南京 210011

熱毒寧對呼吸道合胞病毒感染哮喘模型小鼠的影響*

盧協勤1，杜強2，高天明2，張揚2，翁曉琴2，馮旰珠2**

南京醫科大學第二附屬醫院1藥劑科；2呼吸科，江蘇南京 210011

目的：探討熱毒寧（RDN）對呼吸道合胞病毒（RSV）感染哮喘加重小鼠氣道炎癥的影響。方法：雌性BALB/c小鼠32只，隨機分成4組，分別為對照組、雞卵白蛋白（OVA）組、OVA/ RSV組、OVA/RSV/RDN組。無創肺功能檢測各組小鼠氣道反應性；HE染色觀察肺部炎癥變化；小鼠支氣管肺泡灌洗液（BALF）中炎性細胞計數并分類；ELISA法檢測BALF中IL-4、IL-5、IL-13、IFN-γ含量。結果：RSV感染能夠加重哮喘小鼠氣道炎癥與氣道高反應性，RDN抑制RSV感染哮喘加重小鼠氣道高反應性（P＜0.05）；RDN顯著減少RSV感染哮喘小鼠BALF中IL-4、IL-5、IL-13、IFN-γ含量。結論：RDN可以減輕RSV感染的小鼠氣道炎癥反應，抑制氣道高反應性。

呼吸道合胞病毒；哮喘；氣道炎癥；熱毒寧

支氣管哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病，氣道炎癥由多種炎性細胞，如嗜酸粒細胞、肥大細胞、T淋巴細胞、中性粒細胞、平滑肌細胞等參與所致。呼吸道合胞病毒（RSV）感染是導致哮喘急性發作的重要因素之一，RSV感染導致哮喘氣道炎癥加重，患者激素不敏感[1]。熱毒寧注射液由青蒿、金銀花、梔子3味中藥提取精制而成，是一種抗菌抗炎的中成藥，具有清熱、疏風、解毒等功效。本研究應用熱毒寧（RDN）干預RSV感染哮喘小鼠模型后，觀察其對氣道炎癥和高反應性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

6～8周齡的雌性SPF級BALB/c純系小鼠〔上海斯萊克實驗動物中心，生產許可SCXK（滬）2012-0002〕共36只，投放南京醫科大學動物中心飼養（設置環境溫度為25℃，濕度為70%）。使用專用于測定小動物的肺功能分析系統AniRes2005分析軟件（北京貝蘭博科技有限公司）；雞血清卵蛋白（OVA，Ⅴ級，美國Sigma公司）；RSV A亞型原型株Long株由江蘇省人民醫院呼吸科贈予[2]；IL-4和干擾素-γ（IFN-γ）的酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒購自北京達科為生物技術有限公司；IL-5、IL-13的ELISA檢測試劑盒購自美國ADL公司。

1.2 方法

1.2.1 哮喘模型小鼠的制備和分組隨機將32只小鼠分為4組，即正常對照組、OVA組、OVA/RSV組和OVA/RSV/RDN組，每組8只。

動物模型制作和分組：（1）OVA組：腹腔注入0．2 mL致敏溶液（包括OVA 100 μg，氫氧化鋁凝膠1 mg），第21天起小鼠霧化吸入1%OVA激發，每次30 min，每天1次，連續5天。（2）OVA/RSV組：致敏、激發同OVA組，第21天鼻腔滴入滴度為1．0× 106空斑形成單位（PFU）的RSV 50 mL。（3）OVA/ RSV/RDN組：致敏、激發、病毒接種同前組，第21天起接種RSV后腹腔注射RDN 0．2 mL（江蘇康緣藥業股份有限公司生產，批號：140227），每天1次，連續5天。（4）正常對照組：以PBS代替OVA致敏、激發和RSV鼻腔滴入。

1.2.2 小鼠氣道反應性激發實驗OVA末次激發小鼠24 h后，用3%戊巴比妥鈉（70 mg·kg-1）腹腔注射麻醉，行氣管切開、氣管插管，同時行尾靜脈穿刺置管，將小鼠放入密閉的體描箱中，連接小型動物呼吸機行輔助通氣，動物呼吸機參數設置為：呼吸頻率90次/min，吸呼比為1．0∶1．5，潮氣量為6 mL·kg-1。每只小鼠分別給予逐漸增加的氯化乙酰膽堿（ACH），濃度為0、10、30、90、270μg·kg-1，采用AniRes 2005動物肺功能分析系統測定氣道阻力[3-4]。

1.2.3 小鼠血清和支氣管肺泡灌洗液（BALF）細胞檢測支氣管肺泡灌洗（BAL）4組小鼠，眼眶靜脈采血后行支氣管肺泡灌洗，分3次緩慢注入生理鹽水，每次注入量為0．4 mL，每次灌洗后立即回收置于離心管中，計量。BAL離心（1000 g，10 min）后細胞沉渣做瑞士染色并分類，上清液-70℃備用，行IFN-γ、IL-4、IL-5和IL-13檢測。參照ELISA檢測試劑盒使用說明書檢測BALF中細胞因子和血清總IgE水平的含量。

1.2.4 小鼠肺組織病理改變取小鼠的左上葉肺組織，使用10%中性福爾馬林液固定，石臘包埋、脫水、切片后進行HE染色。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 各組小鼠氣道反應性的比較

經不同濃度的ACH激發以后，各組小鼠氣道阻力變化見圖1。在ACH濃度為10、30 μg·kg-1時各組小鼠氣道阻力無顯著性差異（P＞0．05）。當ACH的濃度分別為90和270 μg·kg-1時，OVA/RSV組較OVA組和正常對照組相比較，小鼠的氣道阻力明顯增加；OVA/RSV/RDN組與OVA/RSV組相比較，小鼠的氣道阻力明顯降低，差異有統計學意義（P＜0．05）。

圖1 各組小鼠氣道反應性的比較（±s，n=8）

2.2 各組小鼠BALF中炎性細胞計數

與正常對照組相比，OVA組和OVA/RSV組BALF總細胞數明顯升高，其中OVA/RSV組升高明顯，主要為嗜酸性粒細胞和中性粒細胞，與OVA組有統計學意義（P＞0．05）；OVA/RSV組經熱毒寧（RDN）治療后BALF中細胞總數以及嗜酸性粒細胞和中性粒細胞顯著下降，與OVA/RSV組相比有統計學意義（P＜0．05）。見圖2。

圖2 小鼠BALF總細胞數及細胞分類（±s，n=8）

2.3 HE染色光鏡觀察

正常對照組小鼠支氣管管腔以及血管周圍未見明顯的炎性細胞的浸潤。OVA組和OVA/RSV組小鼠支氣管管腔周圍及黏膜下可見大量炎性細胞的浸潤，肺泡腔內可見炎性滲出，其中OVA/RSV組較OVA組更加明顯。而OVA/RSV/RDN組較OVA/ RSV組明顯減輕。見圖3。

圖3 各組小鼠病理結果的比較（HE染色）

2.4 各組小鼠BALF和血漿中細胞因子水平的比較

見表1。

3 討論

流行病學研究表明，呼吸道病毒感染是哮喘急性加重、致死的重要原因之一，因重度哮喘死亡患者的肺標本常檢測到呼吸道合胞病毒[5-6]。由于已經感染過RSV的成人可以再次被同株的RSV感染，且缺乏有效的治療手段，因此在哮喘的發病過程中針對RSV的抗感染研究具有重要意義。

表1 各組小鼠BALF中IFN-γ、IL-4、IL-5和IL-13水平比較（±s，n=6）

表1 各組小鼠BALF中IFN-γ、IL-4、IL-5和IL-13水平比較（±s，n=6）

*與正常組相比有統計學意義（P＜0.05）#與OVA/RSV組比較有統計學意義（P＜0.05）

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熱毒寧是臨床上常用的一種兼具抗菌、抗病毒作用的中成藥，具有抗感冒、退熱等作用，其臨床療效表明還具有抗炎、抑制機體非特異性炎癥、提高機體抗氧化的能力。國內學者利用熱毒寧治療哮喘模型，發現其能夠抑制哮喘模型的氣道炎癥[7]。在本研究中發現，與OVA組比較，OVA/RSV組小鼠氣道炎癥、氣道阻力（RL）明顯增加，提示哮喘經RSV感染可顯著增加氣道炎癥與氣道高反應性，炎性細胞計數及分類表明中性粒細胞和嗜酸性粒細胞明顯增多；BALF中Th2細胞因子IL-4、IL-5和IL-13明顯升高，同時發現Th1細胞因子IFN-γ也顯著升高。使用熱毒寧治療后發現，RSV感染誘導加重的氣道炎癥與氣道高反應性得到明顯的減輕，提示熱毒寧對于哮喘感染RSV具有較好的治療價值。

總之，本研究結果提示熱毒寧能夠顯著抑制RSV誘導的哮喘小鼠模型的氣道炎癥、降低氣道高反應性。具體的機制有待今后的實驗進一步闡明。

[1] Bera MM,Lu B,Martin TR,et al.Th17 cytokines are critical for respiratory syncytial virus-associated airway hyperreponsivenessthroughregulationbycomplement C3a and tachykinins[J].J Immunol,2011,187(8): 4245-55.

[2] Jiang XB,Huang M,Cui XF,et al.Respiratory syncytial virus infection differentiates airway dysfunction in the central and peripheral airways in OVA-sensitized mice[J].Exp Lung Res,2012,38(9-10):453-62.

[3] Zha WJ,Qian Y,Shen Y,et al.Galangin Abrogates Ovalbumin-Induced Airway Inflammation via Negative Regulation of NF-κB[J].Evid Based Complement Alternat Med,2013,2013:767689.

[4] Du Q,Gu X,Cai J,et al.Chrysin attenuates allergic airwayinflammationbymodulatingthetranscription factors T-bet and GATA-3 in mice[J].Mol Med Rep, 2012,6(1):100-4.

[5] Teichtahl H,Buckmaster N,Pertnikovs E.The incidence of respiratory tract infection in adults requiring hospitalization for asthma[J].Chest,1997,112(3):591-6.

[6] O'Sullivan S,Cormican L,Faul JL,et al.Activated cytotoxic CD8+T lymphocytes contribute to the pathology of asthm a death[J].Am J Respir Crit Care Med, 2001,164(4):560-5.

[7] 范廣民，葉斌，李紹波，等.熱毒寧注射液對哮喘大鼠肺組織病理改變及TRAF2表達的調控作用[J].浙江中西醫結合雜志，2012，22（1）：3-5.

Effect of Reduning on Respiratory Syncytial Viruses Induced Airway Inflammation and Asthma Exacerbation in Mice*

LU Xie-qin1,DU QIANG2,GAO Tian-ming2,ZHANG Yang2,WENG Xiao-qin2,FENG Gan-zhu2**1Department of Pharmacy;2Department of Respiration,the Second Affiliated Hospital of Nanjing Medical U-niversity,Nanjing Jiangsu 210011,China

Objective：To evaluate the effect of Reduning(RDN)on respiratory syncytial virus(RSV)-induced airway inflammation and asthma exacerbation in Balb/c mice.Methods：Thirty-two female mice were randomly divided into 4 groups(n=8 for each group):control group,OVA(ovalbumin)group,OVA/ RSV group and OVA/RSV/RDN group.Airway responsiveness was assessed using a whole body plethysmography.Lung histopathological changes were evaluated by HE stain.Cells in bronchoalveolar lavage fluid (BALF)were counted and classified,the supernatants of the BALF were used for detection of interleukin (IL)-4,IL-5,IL-13 and interferon(IFN)-γ.Results：RSV infection induced airway inflammation and airway hyper-responsiveness(AHR)exacerbation.Administration of RDN remarkably inhibited airway inflammation and AHR.IFN-γ,IL-4,IL-5 and IL-13 levels in BALF decreased in OVA/RSV/RDN group compared with OVA/RSV group(P<0.01,respectively).Conclusion：RDN might suppress airway inflammation and AHR in RSV infected asthmatic mice.

Respiratory syncytial viruses;Asthma;Airway inflammation;Reduning

R965.1

A

1673-7806（2014）06-499-03

江蘇省衛生廳醫學科技發展基金臨床藥學科研課題（奧賽康基金課題）（P200960）；江蘇省中醫藥管理局科研項目（LZ13228）；南京市衛生局科研項目（YKK13176）

盧協勤，男，副主任藥師 E-mail:luxieqin@sohu.com

* *通訊作者 馮旰珠，男，主任醫師 E-mail:zhu1635253@163.com

2014-07-30

2014-10-01