TBA-Pb2+-hemin模擬酶催化顯色法測定水中痕量鉛

劉珊渡，楊雪蔚，周武雄，王永生

(南華大學公共衛生學院，湖南衡陽 421001)

鉛是一種環境中普遍存在的重金屬污染物，有蓄積毒性，能造成人體多器官、多系統的損害［1］。因此，環境中鉛的檢測尤為重要。目前，鉛的檢測方法主要有原子吸收法［2］、分光光度法［3］、電化學方法［4］等。但要實現快速、低成本、穩定、靈敏的檢測，仍然是一個具有挑戰性的課題。

近年來，適體由于其特異性和穩定性好而被廣泛應用于生物傳感領域。凝血酶適體(TBA)(序列為 5'-GGT TGG TGT GGT TGG-3')［5］，能特異性地結合 Pb2+，形成 G-四聚體結構［6］。

本文基于該G-四聚體與氯化血紅素(hemin)結合后，形成辣根過氧化物模擬酶［7］，可催化H2O2氧化 2，2'-連氮-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)，生成藍綠色自由基產物，導致體系在416 nm處的吸光度增加的原理，建立測定Pb2+的比色新方法，并應用于環境水樣測定。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

硝酸鉛、Tris-HCl緩沖液等均為分析純;TBA，色譜純;實驗用水為滅菌二次蒸餾水。

UV2550型紫外-可見分光光度計;AB204-S型電子分析天平;HH-W21-600型電熱恒溫水浴箱;PB-21精密酸度計。

1.2 實驗方法

于1.5 mL EP 中，依次加入 0.1 mol/L pH 7.4的 Tris-HCl緩沖液 200 μL，1.0 × 10－6mol/L TBA溶液50 μL，1.0 ×10－7mol/L 鉛標準溶液適量，室溫反應40 min。加入2.0×10－5mol/L hemin溶液50 μL，放置 60 min。加入 5.0 × 10－3mol/L ABTS溶液 50 μL 和 1.2 ×10－2mol/L H2O2溶液 50 μL，用蒸餾水稀釋至500 μL，避光放置10 min。在紫外-可見分光光度計上200～700 nm波長范圍內進行掃描，得到吸收光譜。取最大吸收波長415 nm處的吸光度值A和試劑空白A0，得到△A=A－A0。

2 結果與討論

2.1 吸收光譜

由圖1可知，TBA-hemin-ABTS-H2O2體系在415 nm處的吸光度值很低，加入Pb2+后，體系在415 nm的吸光度增強(圖1A)?？赡艿睦碛墒?，Pb2+能夠促進富G序列的凝血酶適體(TBA)生成G-四聚體結構，G-四聚體和氯化血紅素復合物具有過氧化物模擬酶活性，能夠催化H2O2氧化2，2'-連氮-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)，生成藍綠色自由基產物，導致體系在416 nm處的吸光度增加。隨著體系Pb2+濃度的增加，體系的吸光度值相應增加，并在一定范圍內與Pb2+濃度具有良好的線性關系(圖1B)。據此，建立了DNA模擬酶催化顯色法測定Pb2+的新方法。

圖1 Pb2+測定體系吸收光譜Fig.1 Absorption spectra of Pb2+systemA:cPb2+=2.0 ×10－9mol/L，cTBA=1.0 ×10－7mol/L;B:cPb2+:(1 ～7)/(×10－9mol/L)=0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.5，2.0

2.2 實驗條件的優化

2.2.1 緩沖體系的選擇 實驗了 Tris-HCl、Tris-CH3COOH和HEPES三種緩沖液對體系的影響。結果表明，體系在Tris-HCl緩沖溶液中△A最大，線性關系最好;進一步實驗不同pH的影響，結果表明，pH 在6.8～7.4之間△A 逐漸增大，7.4 ～7.6 之間△A較大且穩定，7.6～8.0之間△A逐漸減小，因此，實驗選擇pH 7.5的Tris-HCl緩沖溶液。

2.2.2 TBA用量的選擇 研究了TBA濃度對于體系的影響，結果表明，TBA 濃度在 0.2×10－7～1.0×10－7mol/L逐漸升高，當濃度 達到 1.0 ×10－7mol/L時趨于穩定。因此，體系TBA濃度選擇1.0 ×10－7mol/L。

2.2.3 Hemin用量的選擇 研究了hemin的用量對反應體系的影響，實驗結果表明hemin用量在10～40 μL 范圍內，ΔA 逐漸增大，40～60 μL 范圍內趨于穩定，＞60 μL后，ΔA逐漸減小。所以實驗選擇2.0 ×10－5mol/L hemin 用量為50 μL。

2.2.4 c(ABTS):c(H2O2)的選擇 結果顯示，當c(ABTS)∶c(H2O2)為1∶2.4時，ΔA最大且基本恒定，而當ABTS的量過多或過少時，ΔA均減小。故實驗選擇 c(ABTS):c(H2O2)=1∶2.4。

2.2.5 反應溫度及時間的影響 實驗了20～100℃以及10～100 min內，反應體系吸光度的變化，結果表明，選擇20～25℃下，反應40～60 min時，體系ΔA最大且基本穩定。

2.2.6 試劑加入順序的影響 在以上優化的實驗條件，設計不同試劑加入順序，分別測定其吸光度變化值。實驗發現，以Tris-HCl→TBA→Pb2+→ Hemin→ABTS→H2O2→H2O的加入順序所得體系的△A最大。

2.2.7 標準曲線、檢測限與精密度 按以上優化的實驗條件，分別測定吸光度，繪制標準曲線，實驗結果表明，線性范圍為 1.07 ×10－10～6.01 ×10－7mol/L，線性回歸方程為 ΔA=0.409c(×10－9mol/L)+40.7，相關系數 r=0.996 6;對 Pb2+為1.5 ×10－8，6.0 ×10－8，1.5 ×10－7mol/L 的 3 種標準溶液進行7次平行測定，相對標準偏差為0.67%，1.25%和 3.45%;經 11 次空白平行測定，按照 CL=3Sb/k公式計算，檢出限為 3.21×10－11mol/L。

2.3 共存物質的影響

根據可能共存的實際情況，考察了多種干擾物質對測定結果的影響，結果表明，當相對誤差控制在±5% 以內時:500 倍量的 Fe3+、Cu2+、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Al3+、Zn2+、Ba2+、Fe2+、Ni+、Co2+、Cr3+、Cd2+、Cl－、NO3－;10 倍量的 Na+、Hg+、K+均不干擾測定。

2.4 樣品分析

采集了2份分別來自湘江不同水域的水樣。按本實驗方法對每份樣品做6次平行測定，并進行加標回收實驗，結果見表1。

表1 環境水樣測定結果(n=6)Table 1 The determination results of Pb2+in environmental water samples

3 結論

在pH 7.5 Tris-HCl緩沖溶液中，以TBA為識別元件，ABTS為顯色劑，建立了基于過氧化物模擬酶的鉛離子比色檢測新方法。方法線性范圍為1.07×10－10～ 6.01 × 10－7mol/L，檢出 限 為 3.21 ×10－11mol/L，方法靈敏度高、特異性好，結果滿意。

［1］金海麗.鉛毒性的研究進展［J］.廣東微量元素科學，2004，11(10):9-14.

［2］Chen J，Teo K C.Determination of cadmium，copper，lead and zinc in water samples by flame atomic absorption spectrometry after cloud point extraction［J］.Analytica Chimica Acta，2001，450(1):215-222.

［3］Ahmed M J，Mamun M A.Spectrophotometric determination of lead in industrial，environmental，biological and soil samples using 2，5-dimercapto-1，3，4-thiadiazole［J］.Talanta，2001，55(1):43-54.

［4］Huang M R，Gu G L，Shi F Y，et al.Development of potentiometric lead ion sensors based on ionophores bearing oxygen/sulfur-containing functional groups［J］.Chinese Journal of Analytical Chemistry，2012，40(1):50-58.

［5］白金，燕淤搖，馬福祥，等.水樣中鉛離子含量的測定［J］.大學化學，2013，28(1):37-39

［6］付曉蓓.共振瑞利散射測定孔雀石綠，鉛和凝血酶的新方法研究［D］.重慶:西南大學，2012.

［7］李旺.金屬納米粒子與DNAzyme在電化學與比色傳感中的研究與應用［D］.長沙:湖南大學，2011.