適合豆乳發酵的乳酸菌篩選及其應用*

陳濤，馬映昆，陳福生

1(環境食品學教育部重點實驗室，湖北武漢，430070)2(華中農業大學食品科技學院，湖北武漢，430070)

酸豆乳是一種以新鮮豆乳為原料，經乳酸菌發酵而成的風味獨特、營養豐富的新型功能性豆制品，它既能發揮大豆的營養功效，又能減少大豆中的不良因子，具有改善血壓、調節血脂等多方面的功能［1－2］。酸豆乳含有豐富的植物蛋白、不飽和脂肪酸、人體必需的18種氨基酸和提高人體免疫機能的大豆低聚糖和大豆異黃酮等功能成分，且不含膽固醇和乳糖，是高血壓及乳糖不耐癥患者的良好選擇［3］。

國內外對微生物發酵制作酸豆乳進行了廣泛的研究，這些研究主要集中在發酵條件［3－4］，酸豆乳的風味［5－7］，營養成分及活性物質［8－10］等方面。已有的研究表明發酵菌種的特性和發酵條件對酸豆乳的感官品質和營養價值影響很大。本課題組前期從某醋廠酒醅中篩選鑒定了28株乳酸菌，綜合益生特性，從中選擇了生長特性較好的10株菌用于酸豆乳發酵。本研究通過馴化和篩選，從10株乳酸菌中篩選了1株發酵乳桿菌(L6－2)和1株干酪乳桿菌(L4－4)，其中L4－4表現出較強的酸化能力和分解作用，產生的風味較好，L6－2發酵酸乳組織狀態優良，后酸化能力較弱，利于酸乳的貯存，因此考慮將二者進行混合發酵，以期綜合2株菌的優點。以篩選得到的2株乳酸菌為發酵菌種，以大豆和和脫脂奶粉為原料，通過單因素實驗研究了混合發酵制作酸豆乳的條件，比較了混合發酵和單菌株發酵感官指標和主要營養成分的差異。本研究為酸豆乳食品的開發提供了參考，具有一定的應用前景。

1 材料與方法

1.1 原料

1.1.1 原料和試劑

大豆，脫脂奶粉，市售;菌株:乳酸菌L3－2，L3－3，L4 －1，L4 －4，L5 －3，L5 －4，L5 －6，L6 －2，L6 －4，L6－5，本實驗室分離并保藏;乳酸標準品(色譜純)，美國Supelco公司;其他試劑均為國產分析純。

1.1.2 主要儀器設備

E2695型高效液相色譜儀，美國 Waters公司;L8000型全自動氨基酸分析儀，上海滬西分析儀器廠有限公司;TA.XT.Plus型質構儀，英國Stable Micro Systems公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 豆乳的配制

以5%NaHCO3浸泡大豆2 h，再用60℃蒸餾水磨漿后去渣，調整豆水比為1:8制成豆漿，配制10%(m/V)脫脂奶粉復原牛乳，豆漿和牛乳按9∶1比例混合，添加8%的白砂糖(m/V)，制成豆乳原液，分裝于三角瓶內，115℃滅菌20 min，冷卻至常溫備用。

1.2.2 連續轉接實驗

將處于對數生長期的乳酸菌菌液按5%比例轉接到豆乳原液中37℃發酵。凝乳后記錄凝乳時間，達發酵終點后按5%在接種到新的豆乳原液中，如此反復轉接7次，觀察凝乳狀態和酸度變化情況。

1.2.3 菌種的馴化

將菌種分別接種到含等量牛乳和豆乳的培養液中，在37℃條件下連續傳代培養5次，再傳至牛乳和豆乳比例為4∶6的培養液中，依次降低牛乳的比例，如此連續傳代，直至牛乳和豆乳的比例為1∶9，使菌種適應在豆乳中的生長，達到馴化目的。在傳代過程中要隨時觀察，如發現菌體形態明顯變化、凝乳狀態不佳、乳清析出增加、菌數減少、產酸下降等情況時，說明菌種退化，應及時進行復壯，使其達到穩定狀態后，再繼續傳代馴化，直至該菌株正常生長，完全適應為止。

1.2.4 發酵指標測定

酸度測定:以吉爾涅爾度°T為酸度測定指標，按GB5413.34—2010《乳和乳制品酸度的測定》的方法測定。

后酸化能力測定:將到達發酵終點的酸豆乳放入4℃冰箱冷藏，測定酸乳冷藏1、7、14及21 d后的酸度變化情況及活菌數變化情況。

活菌數的測定:將發酵樣品用滅菌生理鹽水梯度稀釋至一定倍數后，采用MRS瓊脂培養基平板傾注法，37℃培養48 h后菌落計數，計算各菌株活菌數。

保水性測定參考蔡自建等的方法［11］:離心管重W0放入樣品后重W1，3 000 r/min離心30 min，靜置10 min后去除上清液，此時重量為W2。保水率計算公式為:

1.2.5 單因素實驗

菌種配比(V/V):用于混合發酵2種菌的種子液(在豆乳中37℃培養12 h得到)分別以2∶3、1∶1和3∶2的比例進行復配發酵。以酸度變化情況，綜合感官評定來篩選菌種配比。

接種量(V/V):菌株配比確定后，分別按2%、3%、4%、5%及6%的接種量接種，37℃發酵12 h，測定發酵乳滴定酸度，并進行感官評定和活菌數計數來確定接種量。

發酵溫度:為研究發酵溫度對酸豆乳感官品質的影響，按照菌種配比1∶1，接種量為5%，選擇28、30、37、42℃，發酵時間12 h，4℃后熟24 h后進行感官品質評定，以此結果來確定發酵溫度。

發酵時間:按照菌種配比1∶1，以5%的接種量，37 ℃恒溫發酵，分別測定發酵 6、8、10、12、14 h 后成品的酸度值，確定酸豆乳發酵時間。

1.2.6 感官指標檢測方法

感官評定方法如下:根據酸奶組織狀態、滋味、氣味、口感等4項指標綜合打分，總分為100分。各項指標評分標準見表1。

表1 發酵乳感官評分標準Table 1 The sense evaluation standard of fermented soymilk

1.2.7 酸豆乳指標測定

1.2.7.1 酸豆乳質構特性測定

酸豆乳的質構參數采用質構儀測定，參考范宇等的方法［12］。硬度、黏附性、彈性、黏聚性、黏度和回彈性等質構參數的定義及表征參考孫彩鈴等的方法［13］。

1.2.7.2 酸豆乳氨基酸含量測定

采用氨基酸自動分析儀測定，參照 GB/T 5009.124－2003《食品中氨基酸的測定》中的方法。

1.2.7.3 酸豆乳還原糖含量測定

直接滴定法，參照GB/T 5009.7－2008《食品中還原糖的測定》的方法。

1.2.7.4 酸豆乳粗蛋白含量測定

凱氏定氮法，參照GB/T 5009.5－2010《食品中蛋白質的測定測定》的方法。

1.2.7.5 酸豆乳脂肪含量的測定

蓋勃法，參照GB5413.3－2010《嬰幼兒食品和乳品中脂肪的測定》的方法。

1.2.7.6 酸豆乳乳酸含量測定

乳酸的測定采用GB/T 5009.157－2003《食品中有機酸的測定》中的高效液相色譜法，在此方法的基礎上進行了改進。

流動相配制:精確稱取2.721 8 g KH2PO4，以純水定容到1 L，用1 mol/L的H3PO4調 pH 為2.5，用0.45 μm微孔濾膜過濾，再經超聲脫氣作為流動相。

色譜條件:Kromasil C18色譜柱 4.6 mm×250 mm;流動相:20 mmol/L的KH2PO4溶液(pH 2.5);流速為0.8 mL/min;柱溫為30℃;進樣量為10 μL;紫外檢測波長為210 nm。

乳酸標準溶液配制:吸取100 μL色譜純乳酸到10 mL純水里，制成濃度為12.06 mg/mL的乳酸原液，在此基礎上以純水稀釋到2×、4×、10×、20×的不同倍數，以0.45 μm微孔濾膜過濾制成乳酸標準溶液。

樣品預處理:取2 mL豆乳以流動相稀釋2倍，混勻30 s，離心 (12 000 r/min，10 min)，取上清液用0.45 μm孔徑的濾膜過濾即得到待測液。

定性與定量:在相同色譜條件下，將樣品色譜圖與乳酸標液色譜圖對比，根據乳酸出峰的保留時間來定性，以不同濃度標準液色譜圖的峰面積積分值與濃度繪制標準曲線，根據樣品色譜圖峰面積可計算出樣品中乳酸的含量。

2 結果與討論

2.1 乳酸菌的篩選和馴化

2.1.1 轉接試驗結果

乳酸菌某些重要代謝特征如產酸、黏度等是由質粒所攜帶的基因控制，菌株在傳代過程中可能使這些特征性狀丟失［14］，因此，需要對其遺傳穩定性進行考察。乳酸菌連續傳代7次產酸能力變化見圖1。

圖1 乳酸菌在豆乳中連續傳代產酸能力變化曲線Fig.1 The curve of acid producing ability by LAB during successive fermentation

如圖1所示，10株菌轉接過程中穩定性不是很好，只有L3－3，L4－4的滴定酸度維持在90°T以上的水平，其他菌株產酸能力較弱，可能是菌株不適合于豆乳發酵，或是沒有適應在豆乳中的生長，需要對其進行馴化以適應豆乳發酵體系。

2.1.2 菌株經馴化后試驗結果

豆乳與牛乳體系有很大的差別，利用乳酸菌在牛乳中生長較好的特性，采用先將乳酸菌在等量牛乳，豆乳培養體系中連續傳代，再逐步降低培養體系中牛乳的方式來馴化乳酸菌［15］，馴化后的發酵指標結果見表2。

表2 乳酸菌發酵豆乳指標測定Table 2 Determination of fermented soymilk index by LAB

經過馴化以后，各菌株的發酵狀態均有所改善，產酸能力增強，部分菌株發酵乳組織狀態明顯變好，綜合各項指標判斷，選取L3－2、L4－1、L4－4及L6－2進一步發酵特性分析。

2.1.3 四株菌分別用于豆乳發酵研究

分別以5%的接種量接種到滅菌處理的豆乳中37℃恒溫發酵10 h，比較酸化能力，后酸化能力以及冷藏期間活菌數的變化情況。如圖2所示。

從圖2中可以看出，發酵12 h以后，4株菌產酸速率減緩，開始步入穩定期，L4－4產酸能力最強，酸度在90°T以上，而 L3－2，L4－1，L6－2三菌株產酸能力相對較弱，在60～70°T，發酵產品活菌數均在109CFU/mL以上，4℃貯存21 d內酸度變化在10°T以內，活菌數在貯存7 d以內仍然保持較高的活菌數，之后開始下降，這些指標均符合發酵酸奶的基本要求，即酸度在70～110°T內，活菌數106CFU/mL以上，4℃存放保證21 d酸度變化不超過10°T。

圖2 四株菌發酵豆乳酸化能力，后酸化能力以及冷藏期間活菌數比較Fig.2 The curve of titratable acidity of fermented soymilk by 4 LAB strains with fermented(A)，storage time(B)and viable count(C)

在4株菌中，L4－4表現出較強的酸化能力，分解作用，并且產生的風味較好，L6－2用于發酵乳組織狀態優良，并且后酸化能力較弱，利于酸乳的貯存，考慮將二者進行復配，混合發酵或能起到互相彌補的作用。

2.2 單因素實驗

2.2.1 菌種配比

將 L4 －4，L6 －2 進行菌種復配，采用 3∶2、1∶1、2∶3三種復配比例，按總量5%的接種量接種到滅菌豆乳原液中，37℃恒溫發酵12 h，比較酸度值以及感官評價指標(表3)，確定最佳配比。

表3 菌株不同配比的酸度及感官評定Table 3 The acidity and sensory evaluation under different mixture of strains

由表3可知，當菌種配比為3∶2時酸度較高，而菌種配比為1∶1時感官指標較好，從酸度和感官評定指標綜合判斷，2菌株以1∶1的組合配比發酵產酸適宜，且發酵外觀良好。

2.2.2 接種量

接種量是生產酸豆乳關鍵的一步，不僅關系到酸豆乳發酵過程中的酸度，并且對酸豆乳成品的感官狀態也有很大影響。因此在文獻基礎上，選擇了2%、3%、4%、5%和6%的接種量，37℃恒溫發酵12 h，測定最終發酵產品的活菌數、酸度值，結合感官評定結果，確定接種量的最佳水平。各組酸豆乳達到發酵終點的酸度值、酸豆乳成品的感官評定和活菌數如表4所示。

表4 不同接種量的酸度、感官評定和活菌數比較Table 4 The acidity，sensory evaluation and viable count under different inoculating amounts

由表4可知，當接種量較低時，產酸可能受到抑制且不穩定，導致凝乳不是很好且風味較淡;當接種量較高時，產酸較高，易造成凝乳中蛋白質脫水收縮現象，使乳清析出較多，出現過酸化現象，給發酵乳組織狀態和風味帶來不良的影響。當接種量為5%時，發酵酸乳在口感，狀態上都最好，雖然6%接種量發酵活菌數更多。但綜合考慮酸乳感官品質及可接受性，本實驗最終確定接種量為5%。

2.2.3 發酵溫度

發酵溫度對菌種的活性和酸豆乳的風味都有很大影響，并且不同溫度發酵組織狀態以及后酸化能力都有很大差異。以5%接種量接入豆乳，發酵12 h，感官評價結果見表5。發酵溫度為42℃時，產品的風味及組織狀態不佳，伴有尖酸味。發酵溫度28℃產酸不足，酸味不夠。相比之下，37℃發酵產品的組織狀態及風味各方面都比較好，因此確定37℃作為發酵溫度。

表5 不同發酵溫度時發酵酸乳組織狀態Table 5 The quality of fermented soymilk under different fermentation temperature

2.2.4 發酵時間

發酵時間對乳酸菌增殖與產酸影響極為重要。時間過短，則酸豆乳組織不夠堅實，風味不佳;時間過長，酸度過高，乳清過量析出，風味也不佳。以5%的接種量，37℃下恒溫發酵，分別測定發酵8、10、12、14和16 h后的酸度值，并結合感官評定結果，確定酸豆乳發酵的時間。發酵終點酸度值見圖3。

圖3 不同發酵時間酸奶酸度值的變化Fig.3 Change of fermented soymilk’s acidity with different fermentation time

如圖3所示，隨著發酵時間延長，酸豆乳的酸度也隨之升高;當發酵12 h時，酸度升高的趨勢明顯變平緩，這是因為當發酵到8～12 h時，乳酸菌增殖較快，菌活力很強，產酸速率高;而當發酵時間達到10～16 h的范圍時，乳酸菌的生長繁殖達到穩定期，且豆乳已凝乳成型，隨著發酵的繼續進行，開始有乳清不斷析出，過酸化現象出現。因此，確定發酵時間為12 h。

2.3 混合發酵和單菌株發酵的比較

2.3.1 混合發酵和單菌株發酵酸豆乳外觀及質構特性的比較

單因素試驗得到的發酵條件為:菌株配比為1∶1，接種量5%，發酵溫度37℃，發酵時間12 h。因為37℃是很多病原菌的最適溫度，為了避免病原菌的污染，本實驗采用35℃進行酸豆乳發酵，并與2菌株單獨發酵時進行比較，質構特性分析數據見表6。

表6 發酵酸豆乳質構特性分析Table 6 TPA index analysis of fermented soymilk

比較發酵外觀發現，L4－4發酵乳有部分乳清析出，凝乳不結實，而L6－2發酵乳組織狀態良好，無乳清析出，2菌株混合發酵乳的組織狀態比L4－4發酵乳明顯改善，無乳清析出，貼壁良好;從發酵乳的質構特性(表6)來看，L6－2發酵乳各項質構測試指標都顯示出其具有良好的質構特性，而混合發酵酸豆乳在組織狀態、硬度、黏附性和黏度等指標也都明顯高于L4－4發酵乳，說明經過菌種復配起到了改善L4－4單獨發酵乳組織狀態的作用。

2.3.2 混合菌株和單菌株發酵酸豆乳營養指標比較以L4－4，L6－2混合菌株發酵酸豆乳，并與2菌株單獨發酵酸豆乳中的粗蛋白、還原糖、粗脂肪和乳酸的含量進行比較，結果如表7。

表7 單菌株和混合菌株發酵豆乳營養指標比較Table 7 Nutrition index of fermented soybean milk by L4－4，L6－2 and mix

由于磨漿時豆水比選擇的不同，發酵酸豆乳中蛋白質，脂肪等的含量也各不相同，目前還沒有一個專門的標準來規定酸豆乳的營養成分含量，所以本研究僅從乳酸菌分解作用的角度出發，比較了發酵酸豆乳和豆漿原液中各種營養成分的變化，從表7可以看出，3種發酵酸豆乳中還原糖明顯增加，而脂肪的含量的減少，說明經乳酸菌發酵以后，多糖類物質部分被分解為單糖，而脂肪則被分解為游離脂肪酸或是揮發性脂肪酸，表明本研究中采用的乳酸菌具有一定的分解作用，用于發酵酸豆乳有助于營養物質的細化，更利于人體吸收?；旌习l酵酸豆乳中還原糖、乳酸的含量高于L6－2，而脂肪含量低于L6－2，說明混合發酵對營養物質的細化作用好于L6－2。

2.3.3 游離氨基酸分析

大豆經加水磨漿稀釋后，氨基酸總量降低，但其中蛋白質所含必需氨基酸的種類、含量和比例不變，大豆蛋白氨基酸組成是植物性食物中最理想的、最接近人體所需比例的［16］，只是含硫氨基酸(蛋氨酸、胱氨酸)的含量略低(為大豆蛋白質的第一限制氨基酸)。本實驗采用添加脫脂乳到豆漿里作為發酵基質，一方面是為乳酸菌生長提供一些特定的營養物質，另一方面在氨基酸組成上彌補了大豆中某些必需氨基酸的不足。游離氨基酸含量見表8。

表8 樣品的氨基酸成分Table 8 The amino acid composition of samples

經不同種乳酸菌發酵，其產生的代謝酶類不一樣，對蛋白質的分解作用也各不一致，氨基酸類別和組成也會發生改變。由表8可以看出，發酵乳中游離氨基酸的總量經L4－4發酵后增加了6.749 9 mg/100mL，并且必需氨基酸的含量也有所增加;而L6－2發酵乳游離氨基酸含量較原液降低，主要是因為發酵乳桿菌L6－2為精氨酸產氨試驗陽性;混合發酵乳較豆漿原液也增加了3.941 2 mg/100mL，綜合表7中還原糖和脂肪含量的變化，發現L4－4菌株的分解作用較強，L6－2分解作用較弱，2菌株混合發酵彌補了L6－2分解作用較弱的劣勢。

3 結論

本文從10株乳酸菌中馴化篩選出干酪乳桿菌L4－4和發酵乳桿菌L6－2進行混合發酵制備酸豆乳，并以菌種配比、接種量、發酵溫度和時間做單因素實驗，得出混合發酵的工藝條件:菌株配比為1∶1，接種比例為5%，發酵時間12 h，發酵溫度為37℃。對混合發酵和單菌株發酵的酸豆乳進行比較，結果表明，混合發酵的酸豆乳組織狀態優良，硬度、黏附性和黏度等指標明顯優于L4－4單菌株發酵;營養成分方面，混合發酵酸豆乳的還原糖、乳酸和氨基酸的含量高于L6－2單菌株發酵，而脂肪含量低于L6－2單菌株發酵，說明混合發酵對營養物質的細化作用好于L6－2單菌株發酵;混合發酵綜合了2株菌的優點，有望應用于實際生產。

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