探討宮頸癌的放射生物學機理

雒永岐

【摘要】 目的 探討放射前、后人宮頸癌組織增殖細胞核抗原（PCNA）表達的變化。方法 在多聚甲醛固定的活檢癌組織冰凍切片上，進行PCNA的免疫組織化學染色。結果 放療前的宮頸癌組織內，多數癌細胞呈PCNA免疫染色陽性；照射（30-40Gy）后，多數癌細胞無PCNA染色，但間質細胞的PCNA免疫染色明顯升高，大量間質細胞則呈中等或強陽性染色。結論 放射抑制宮頸癌細胞的PCNA表達的同時，誘導間質細胞的PCNA表達。提示PCNA的表達狀態可作為放射治療中評價宮頸癌細胞增殖和間質組織修復的分子指標之一。

【關鍵詞】 增殖細胞核抗原；宮頸癌；放射療法

文章編號：1004-7484（2014）-06-3102-01

近年來宮頸癌已經成為女性患者中較常見的惡性腫瘤疾病，宮頸癌的放射治療方法具有非常好的療效，放療以后的遠期生存率也比較高?？梢?，宮頸癌放射生物學機理的研究，對腫瘤的整體放射水平具有十分深遠的意義。增殖細胞核抗原（PCNA）是一種高度保守的蛋白分子，具有參與DNA復制和DNA修復的功能，PCNA的表達情況是反映細胞增殖狀態的重要指標，研究資料表明PCNA在宮頸癌組織中有表達，但PCNA在宮頸癌放射治療中的意義，有待于進一步闡明。因此我們利用免疫組織化學等方法，對放射治療中宮頸癌組織PCNA的變化及其意義進行了探討。

1 資料和方法

1.1 臨床資料與活檢材料 宮頸癌活檢組織標本20例，取自臨床病理診斷為鱗狀細胞癌患者，病理分級為Ⅰ-Ⅱ?；颊吣挲g為34-58歲。其中，放療前標本9例，放療后標本11例。接受放射治療的患者分別接受盆腔照射30-40Gy/15-20次.宮頸癌活檢組織標本，入40g·L-1多聚甲醛0.1mol·L-1的磷酸緩沖液（pH7.4），4℃下固定24-48h.然后換入30g·L-1蔗糖溶液內，4℃下過夜.冰凍連續冠狀切片，切片厚10μm，每例取30張切片，按順序分為3套，置于-20℃保存備用.染色前將切片晾干，然后分別作常規HE染色、PCNA免疫組化染色和對照染色。

1.2 免疫組織化學染色（ABC法） 切片于10mmol·L-1磷酸緩沖鹽水（PBS，pH7.4）內洗10min，再入含0.3ml·L-1過氧化氫溶液內處理30min，用以滅活內源性過氧化物酶.經PBS洗后，入鼠抗PCNA單克隆抗體（濃縮型第一抗體，從博士德公司購買，用含2ml·L-1正常山羊血清和0.1ml·L-1TritonX-100的PBS稀釋，1∶100）內，于4℃下孵育48h.然后入biotin標記的兔抗鼠IgG（1∶200，Vector公司）溶液內，室溫下放置4h.入ABC復合物（1∶200，Vector公司產品）溶液，室溫下孵育2h.每次抗體孵育后均用PBS洗，3×10min.最后入DAB/H2O2溶液（0.05g·L-1/0.01g·L-1）反應10min.另外，用正常小鼠血清溶液代替特異性第一抗體孵育切片，作為免疫染色對照。

1.3 半定量分析 參照以往文獻中的定量方法，對PCNA免疫染色陽性細胞的半定量分析，在放療前（n=8）和放療后（n=10）活檢組織10μm切片（10張/例）上，隨機選取一高倍視野，計數單位面積（6.25mm2）PCNA免疫陽性細胞數目。

1.4 統計學檢驗 比較放療前與放療后兩組的PC-NA免疫陽性胞體細胞數目（χ±s），進行單因素χ2檢驗。

2 結 果

2.1 宮頸癌組織的病理學觀察 在HE常規染色的切片上，放射前的宮頸組織可見大量的癌細胞巢狀分布，癌細胞呈卵圓形或不規則型，癌細胞增殖旺盛，可見病理性核分裂像，腫瘤間質較少。經15-20次（30-40Gy）的照射后，癌組織明顯減少，少數殘留的癌細胞呈巢狀分布，其間為豐富增生的間質結締組織，伴有大量的白細胞浸潤。

2.2 PCNA免疫陽性反應 在應用特異性第一抗體孵育的切片上，PCNA的免疫反應陽性產物呈深棕色，主要定位于細胞核內，少量陽性產物彌散分布在細胞核膜或核周。在用正常血清取代特異性第一抗體進行孵育的切片上，未見到PCNA的陽性染色。

2.3 PCNA免疫陽性細胞的分布 放射前宮頸癌組織呈PCNA免疫陽性染色，多數癌細胞呈中等程度的著色，部分免疫染色產物彌散分布在核膜與核周胞質內（Fig1）。放射后的活檢組織標本上，殘留的癌細胞巢內檢測不到明顯的PCNA免疫染色，而大量的間質組織細胞顯示強陽性的染色（Fig2）。

3 討 論

以往的研究表明PCNA是真核細胞DNA合成所必需的一種33-36KD的周期蛋白，它是一種DNA聚合酶δ和ε的輔助蛋白，合成于G1和S期，其合成與表達與細胞增殖狀態密切相關.PCNA能與幾種其他DNA復制與修復因子，如引物識別復合體復制因子C、核酸內切酶Fen-1和DNA連接酶I等結合，參與DNA的復制與修復過程.PCNA在腫瘤組織中的表達有許多報道，其中包括宮頸癌癌前病變和癌組織中的表達。這些研究多認為PCNA的表達可以作為癌細胞增殖狀態的生物學標志，即PCNA的表達強，癌細胞的增殖快，反之，則增殖率低.但對于放射對宮頸癌細胞PCNA表達的影響則缺乏研究。有學者研究食管癌放射中PCNA的表達，發現PCNA的表達有變化，并認為在評價放療效果中有意義。我們的研究結果表明，放射治療直接殺死癌細胞的同時，可以抑制宮頸癌細胞增殖，這可能是宮頸癌放療效果較好的原因之一。提示PCNA的表達的變化可以作為宮頸癌放射治療效果的分子指標。

參考文獻

[1] 李玉婷.SCC-Ag在宮頸癌患者術后輔助放療中的意義[D].新疆醫科大學，2008年.

[2] 劉明明，孫勝東，王成林.人宮頸鱗狀細胞癌Bcl-2的表達與放射治療敏感性的關系[J].細胞與分子免疫學雜志，2011年.08期.