優質殼聚糖/殼寡糖的制備工藝及水溶性殼寡糖Fe（Ⅲ）配合物的合成

楊俊玲，趙福龍，夏 軍，張曉波，王 璇

（天津工業大學環境與化學工程學院，天津 300387）

優質殼聚糖/殼寡糖的制備工藝及水溶性殼寡糖Fe（Ⅲ）配合物的合成

楊俊玲，趙福龍，夏 軍，張曉波，王 璇

（天津工業大學環境與化學工程學院，天津 300387）

以皮皮蝦殼作基本原料，分別采用稀鹽酸、稀堿溶液浸泡，除去蝦殼中的鈣質等無機質和蛋白等有機成分，以濃堿脫除甲殼素上的乙?；?，制得殼聚糖.再以其為原料，采用H2O2氧化降解法得到水溶性殼寡糖.將所制水溶性殼寡糖加入到氯化鐵溶液中，設定各項條件，使二者進行配位反應.經系列實驗證實，得出制備高脫乙酰度殼聚糖最適宜條件為：溫度85℃，時間9 h，NaOH質量分數45%，料液比1∶300.所得產品脫乙酰度為89.6%，收率（殼聚糖/甲殼素）為73.1%，其他各項指標也均為優良級.制備水溶性殼寡糖最適宜條件為：溫度65℃，時間6 h，醋酸質量分數4.0%，H2O2質量分數4.0%，產品平均粘均分子質量為2.9 ku，外觀為淡黃色粉末，溶解性能優良.通過對FT-IR和UV譜圖的分析，證實了水溶性殼寡糖Fe（Ⅲ）配合物的生成.

高脫乙酰度殼聚糖；水溶性殼寡糖；水溶性殼寡糖Fe（Ⅲ）配合物

殼聚糖（chitosan，簡稱CTS）是地球上最豐富的天然高分子化合物之一，其在很多領域都展現出較高的應用前景[1].經研究證實，高脫乙酰度殼聚糖（HD-chitosan）在降解、結晶、活細胞和酶的固定化、制作反滲透膜和超濾膜等中具有更優的理化性質[2].因此，高脫乙酰度殼聚糖更具研究意義和應用價值.但殼聚糖的分子質量大，僅溶于少數酸性體系，這限制了其應用前景[3].而其降解產物殼寡糖（COS）的聚合度一般在2～10之間，其水溶性好、易被機體吸收利用，具有抑菌、抗腫瘤等生物活性，在醫藥、食品、農業、環保等領域[4-6]具有廣闊的應用前景，日益受到專家學者以及廠商們的關注[7].由于殼聚糖良好的生物相容性，對其化學改性亦種類繁多[8].其中，與金屬形成配合物是重要一項.因其對過渡金屬具有良好的配位作用，使殼聚糖基金屬配合物材料產生許多優良性能[9-11].目前，以殼聚糖金屬鐵配合物的研究居多，而以水溶性殼寡糖為基質，絡合具有功能特性的過渡金屬鐵（Ⅲ）的報道鮮有見到.為此，本文通過研究殼聚糖/殼寡糖的制備工藝，獲得優質殼聚糖/殼寡糖產品，然后選用更具活性的水溶性殼寡糖作為基質絡合過渡金屬Fe（Ⅲ），再以FT-IR和UV來表征水溶性殼寡糖Fe（Ⅲ）配合物的結構特征.

1 實驗部分

1.1 原材料與儀器

原材料：皮皮蝦殼，市售；過氧化氫，天津大沽精細化工有限公司生產；氫氧化鈉（工業級），濟南永茂化工有限公司生產；鹽酸、醋酸、氫氧化鈉、氯化鐵、鄰菲羅琳等試劑，均為分析純，市售.

儀器：DF-101S-B型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，山東鄄城華魯電熱儀器有限公司生產；紫外分光光度計（UV），北京瑞利分析儀器有限公司生產；370DTGS型紅外光譜儀，美國Thermo公司生產；FA1004型電子天平，上海瞬宇恒平科學儀器有限公司生產；SHZ-3型循環水式真空泵，上?？等A生化儀器制造有限公司生產；電熱真空干燥箱，天津市中環實驗電爐有限公司生產；HK-1D型恒溫水浴槽，南京大學應用物理研究所生產；SX2-4-10型箱式電阻爐，山東省龍口市先科儀器有限公司生產；烏氏粘度計，內徑0.5 mm，淄博現代科學儀器有限公司生產.

1.2 殼聚糖的制備

首先將稱取的皮皮蝦殼清洗干凈，用稀鹽酸浸泡除去鈣質等無機鹽，水洗至中性，加入稀氫氧化鈉（工業級）溶液中攪拌脫除蛋白和酯類，然后與濃氫氧化鈉（工業級）溶液反應脫除乙?；?，過濾水洗至中性后，烘干即得殼聚糖.其間，分別以溫度、時間、氫氧化鈉濃度、料液比為單因素變量，以殼聚糖產品的脫乙酰度為標準，探討殼聚糖的制備工藝條件.按文獻[12-13]的方法對殼聚糖脫乙酰度進行測定.

1.3 殼寡糖的制備

準確稱取所制殼聚糖產品（采取優化條件下產品：脫乙酰度為89.6%；粘均分子質量為8.8×106），并溶入一定質量分數的乙酸中，待完全溶解后，設定溫度，緩慢加入雙氧水，恒溫攪拌水浴中降解，調節至中性后蒸餾濃縮，用3倍體積的無水乙醇進行醇沉，靜置過夜.真空干燥后即得水溶性殼寡糖產品.其間，分別以溫度、雙氧水濃度、醋酸濃度、時間為單因素變量，以寡糖產品的分子質量為標準，研究殼寡糖的制備工藝條件.

1.4 殼寡糖相對分子質量的測定

精確稱取自制殼寡糖樣品，將其溶入0.1 mol/L的乙酸-0.2 mol/L氯化鈉緩沖溶液中，待樣品溶解后，用烏氏粘度計于（25±0.01）℃下恒溫測量樣品粘度，以文獻[14-15]所提方法計算其相對分子質量.

1.5 殼寡糖Fe（Ⅲ）配合物的合成

準確稱取殼寡糖產品（為優化條件下所制），將其加入到一定濃度的氯化鐵溶液中，以0.1 mol/L鹽酸調節pH至1.8左右，然后置于45℃恒溫水浴鍋中絡合反應6 h.反應結束后，調節至中性，有沉淀析出，抽濾，分別以蒸餾水、乙醇-丙酮混合液淋洗.55℃下真空干燥后，即得橙黃色殼寡糖Fe（Ⅲ）配合物.

1.6 紅外光譜表征

采用KBr壓片法對殼寡糖Fe（Ⅲ）配合物進行紅外表征.

1.7 紫外吸收光譜表征

以1.0%醋酸為空白試劑，于190～450 nm波長范圍內測定殼寡糖Fe（Ⅲ）配合物的紫外吸收光譜.

2 結果與分析

2.1 殼聚糖的制備工藝

為研究各因素對脫乙酰反應的影響，分別進行了反應溫度、反應時間、料液比（g∶mL）、NaOH質量分數4個單因素條件實驗，結果如圖1至圖4所示.

圖1 溫度對脫乙酰反應的影響Fig.1 Effect of temperature on deacelation reaction

由圖1可知，溫度對脫乙酰反應的影響較大，溫度在60～70℃之間時，脫乙酰度增加明顯，但其值較低，其應用效果有限；當溫度增大至85～90℃時，可看出脫乙酰度顯著增大，其值能達90%以上.因此，從效能角度考慮，溫度選擇在85℃左右為宜.由圖2可知，增大反應時間有利于提高殼聚糖的脫乙酰度，其影響效應比較接近于線性規律，當時間增加至9 h時，其脫乙酰度接近80%，足可以展現其應用性質.因此，時間選擇在9 h為宜.由圖3可知，隨著NaOH濃度的增大，殼聚糖脫乙酰度的增大呈現前緩、中快、后慢的變化趨勢.當NaOH質量分數增大至45%時，其脫乙酰度就已在85%以上，NaOH質量分數大于45%時，其影響效果逐漸變小.由圖4可知，料液比對脫乙酰反應的影響基本類似于NaOH質量分數的影響，同樣呈現出前緩、中快、后慢的增大趨勢.當料液比達到1∶300時，殼聚糖的脫乙酰度就已增大至80%以上，隨著料液比的繼續增大，脫乙酰度的增大并不顯著.因此，對以上2個因素下的成本、效果等角度綜合分析，可得出：NaOH質量分數選在45%為宜，料液比選在1∶300為宜.從皮皮蝦殼至各階段產品的收率如表1所示.

圖2 時間對脫乙酰反應的影響Fig.2 Effect of time on deacelation reaction

圖3 NaOH質量分數對脫乙酰反應的影響Fig.3 Effect of mass fraction of Sodium hydroxide on deacelation reaction

圖4 料液比對脫乙酰反應的影響Fig.4 Eeffect of ratio of material to solvent on deacelation reaction

表1 從皮皮蝦殼至各階段產品的收率Tab.1 Yield of products from mantisshrimp shell to each stage

為驗證上述反應條件的適宜性，進行了3次脫乙酰反應實驗，結果如表2所示.

表2 優化條件下所制殼聚糖的質量指標分析Tab.2 Quality analysis of chitosan prepared under optimized conditions

從表2中看出，3次實驗所得殼聚糖產品的脫乙酰度平均值為89.6%，收率（殼聚糖/甲殼素）平均值為73.1%，其他各項指標也均為優良級.故可將制備優質高脫乙酰度殼聚糖的最適宜條件定為：溫度85℃，時間9 h，NaOH質量分數45%，料液比1∶300.

2.2 水溶性殼寡糖的制備工藝

為研究各因素對H2O2降解反應的影響，分別進行了反應溫度、反應時間、乙酸質量分數、H2O2質量分數4個單因素條件實驗，結果如圖5至圖8所示.

圖5 溫度對降解反應的影響Fig.5 Effect of temperature on degradation reaction

由圖5可見，溫度對降解反應的影響很顯著，當溫度為40～65℃時，粘均分子質量呈現快速減小趨勢，之后趨勢變得緩和，可得出溫度是影響降解程度的主要因素之一.結合表3分析，溫度變大，雖有利于增大降解程度，但產品顏色加深（可能其他副反應增多），不利于得到優質降解產品，故溫度不宜過高；由圖6可見，隨著降解時間的延長，降解產品的相對分子質量呈現均勻下降趨勢，至6 h時，該趨勢變得緩和，即再增大降解時間，其影響效果亦有限.由圖7可見，醋酸質量分數對降解反應的影響不大，隨著醋酸濃度的增大，產品的分子質量先減小后增大，當醋酸質量分數至4.0%時，達到最低.由圖8可見，隨著雙氧水質量分數增大，降解產品的相對分子質量先快速減小后緩慢增大，質量分數至4.0%時達到最低值，說明雙氧水濃度并非越大越有利于氧化降解.從產品成本、成色品質、效能等角度考慮，再結合以上分析結果，得出制備水溶性殼寡糖的H2O2氧化降解的適宜條件：溫度65℃，時間6 h，醋酸質量分數4.0%，H2O2質量分數4.0%.

圖6 時間對降解反應的影響Fig.6 Effect of time on degradation reaction

圖7 乙酸質量分數對降解的影響Fig.7 Effect of mass fraction of acetic acid on degradation reaction

圖8 雙氧水質量分數對降解的影響Fig.8 Effect of mass fraction of hydrogen peroxide on degradation reaction

表3 不同溫度下制備的殼寡糖成色分析Tab.3 Fineness determination of chitooligosaccharide prepared at different temperatures

為驗證上述反應條件的適宜性，進行了3次H2O2降解實驗.結果為：產品的相對分子質量平均值為2.9 ku，外觀品質為淡黃色粉末，其溶解性能見表4.可看出：降解產品具有良好的溶解性能.驗證結果證明，可將溫度65℃，時間6 h，醋酸4.0%，H2O24.0%定為H2O2氧化降解殼聚糖的最適宜條件.

表4 優化條件下所制殼寡糖在不同溶劑中的溶解性能檢驗Tab.4 Solubility property of chitooligosaccharide prepared under optimized conditions with different solvent systems

2.3 殼寡糖Fe（Ⅲ）配合物的紅外分析

圖9所示為殼寡糖與殼寡糖Fe3+配合物的紅外譜圖.

從圖9中對比可知：位于3 440 cm-1處氨基和羥基的N-H、O-H伸縮振動峰紅移至3 412 cm-1處且峰形變得尖銳，說明了-NH2、-OH可能參與了與Fe3+的配位反應，位于1 634 cm-1處的N-H伸縮振動峰移至1 637 cm-1處，位于1 600 cm-1處的-NH2變形振動峰移至1 617 cm-1處，這進一步說明了-NH2與Fe3+發生了配位；位于1 155 cm-1處的仲羥基C-O伸縮振動峰與1 091 cm-1處的伯羥基C-O伸縮振動峰分別移至1 212 cm-1、1 133 cm-1處，同樣表征了-OH參與了配位.

2.4 殼寡糖Fe（Ⅲ）配合物的紫外分析

圖10為殼寡糖與殼寡糖Fe3+配合物的紫外譜圖.

由圖10可見，殼寡糖在波長范圍內幾乎沒有吸收，而其Fe（Ⅲ）配合物在230 nm處有最大吸收峰，而且其峰形寬而強，其原因可能是配合物中的N、O孤對電子產生了n→σ*躍遷，致使光譜發生變化.由此可知，Fe3+確實與殼寡糖產生了配位反應.

圖9 殼寡糖與殼寡糖Fe3+配合物的紅外譜圖Fig.9 FT-IR spectrum of oligosaccharide and oligosaccharide-Fe3+complex

圖10 殼寡糖與殼寡糖Fe3+配合物的紫外譜圖Fig.10 UV spectrum of oligosaccharide and oligosaccharide-Fe3+complex

3 結論

（1）通過對高脫乙酰度殼聚糖和水溶性殼寡糖的工藝條件研究，優化了二者的制備工藝，得出前者最適宜條件為：溫度85℃，時間9 h，NaOH質量分數45%，料液比1∶300.此條件下所得產品脫乙酰度為89.6%，收率（殼聚糖/甲殼素）為73.1%，其他各項指標也均為優良級.后者最適宜條件：溫度65℃，時間6 h，醋酸質量分數4.0%，H2O2質量分數4.0%，產品平均粘均分子量為2.9 ku，外觀為淡黃色粉末，溶解性能優良.

（2）對配合物的FT-IR和UV譜圖分析表明：殼寡糖分子鏈上的-NH2與-OH確實與Fe3+發生了配位，證實了水溶性殼寡糖Fe（Ⅲ）配合物的生成.

（3）本文系統全面地介紹了優質殼聚糖與水溶性殼寡糖的制備工藝.同時，對水溶性殼寡糖與Fe（Ⅲ）的配位性質進行了初步研究，合成了水溶性殼寡糖Fe（Ⅲ）配合物.可將本文作為高分子材料和金屬有機材料研究的有效參考.

[1]張文博，陳盛.甲殼素/殼聚糖的提取及應用研究新進展[J].福建師范大學福清分校學報，2008，2（1）：18-25.

[2]蔣挺大.殼聚糖[M].北京：化學工業出版社，2007.

[3]季者，蔣霞云，李小倩，等.鹽酸法降解殼聚糖制備特定聚合度殼寡糖的研究[J].上海海洋大學學報，2013，22（4）：635-640.

[4]WANG Yu-Chi，KAO Shu-Huei，HSIEH Hsyue-Jen.A chemical surface modification of chitosan by glycoconjugates to enhancethecell-biomaterialinteraction[J].Biomacromolecules，2003（4）：224-231.

[5]BALAN Vera，VERESTIUC Liliana.Strategies to improve chitosan hemocompatibility：A review[J].European Polymer Journal，2014（53）：171-188.

[6] LIU shing-hwa，CHANG yu-han，CHING meng-tsan.Chitosan reduces gluconeogenesis and increases glucose uptake in skeletal muscle in streptozotocin-induced diabetic Rats[J]. Food Chem，2010（58）：5795-5800.

[7]鄭必勝，周萌.殼聚糖氧化降解制備殼寡糖的研究[J].現代食品科技，2012，28（8）：960-965.

[8]楊俊玲.甲殼素和殼聚糖的化學改性研究[J].天津工業大學學報，2001，20（5）：79-82.

[9]郎惠云，張秀軍.不同分子量的殼聚糖亞鐵配合物的合成及其對尿素的吸附性能[J].食品科學，2005，26（3）：31-34.

[10]姜煒，李鳳生.磁性-Fe2O3/殼聚糖復合微球的制備及性能[J].南京理工大學學報，2006，30（6）：770-773.

[11]王孝平，姜皓然.殼聚糖與羧甲基殼聚糖對鐵離子的絡合性能研究[J].化學與生物工程，2009，26（3）：30-33.

[12]蔣元勛，李海鷹，楊文智，等.殼聚糖脫乙酰度測定方法的總結與比較[J].應用化工，2011，40（10）：1837-1840.

[13]王偉，薄淑琴，秦汶.不同脫乙酸度殼聚糖mrak-houwink方程的訂定[J].中國科學，1990，11（11）：1127-1131.

[14]陳魯生，周武，姜云生.殼聚糖粘均分子量的測定[J].化學通報，1996（4）：7-9.

[15]王亞珍，林雨露，吳天奎.粘度法測高聚物相對分子量實驗成敗探討[J].江漢大學學報：自然科學版，2004，32（4）：59-62.

Preparation process of quality CTS/soluble COS and synthesis of soluble COS-Fe（Ⅲ）complex

YANG Jun-ling，ZHAO Fu-long，XIA Jun，ZHANG Xiao-bo，WANG Xuan
（School of Environmental and Chemical Engineering，Tianjin Polytechnic University，Tianjin 300387，China）

HD-chitosan was produced with basic material-mantis shrimp shell which was removed inorganic salt with chlorhydric acid,proteins with dilute alkali solution,then dislodged acetyl group with concentrated alkaline solution.Next,the above-mentioned HD-chitosan was degraded with H2O2for producing soluble COS.With adjusted conditions,the soluble COS was added to ferric chloride solution for complexing.It was confirmed by series of experiments that the optimized conditions of preparing HD-chitosan was 45%NaOH,the ratio of material to solvent(g/ml）1∶300,and at constant temperature 85℃for 9 h.The yield of HD-chitosan to chitin was 73.1% with other excellent quality index.The optimized conditions of preparing soluble oligosaccharide was 4.0%acetic acid,4.0%H2O2and at constant temperature 65℃for 6 h.The viscosity average molecular weigh of products was 2.9 ku.In addition,it was also observed that the products of oligosaccharide was desirable faint yellow powder and had fine solubility.According to analysis of FT-IR and UV spectrum,the formation of soluble COS-Fe(Ⅲ）complex was certified.

HD-chitosan；soluble COS；soluble COS-Fe（Ⅲ）complex

TQ314.1

A

1671-024X（2014）05-0039-05

2014-05-20

國家自然科學基金項目（21101113）

楊俊玲（1957—），女，教授，碩士生導師.E-mail：yangjunling@tjpu.edu.cn