克雅二氏病研究與診斷進展

何 敏,陳文武,成克定,姬新穎1,*

(1.河南大學醫學院抗體藥物河南省工程實驗室,河南開封475004;2.河南護理職業學院內科,河南安陽455001; 3.河南大學第一附屬醫院神經內科,河南開封475001)

克雅二氏病研究與診斷進展

何 敏1,2,陳文武3,成克定3,姬新穎1,3*

(1.河南大學醫學院抗體藥物河南省工程實驗室,河南開封475004;2.河南護理職業學院內科,河南安陽455001; 3.河南大學第一附屬醫院神經內科,河南開封475001)

克雅二氏病(Creutzfeldt-Jakob disease,CJD)是朊粒(prion)類疾病在人類中最常見的病種,與其他常見的傳染病不同的是,這個疾病不是由類似于含有基因的病毒或細菌的病原造成的疾病,而是由變構蛋白朊粒直接造成的疾病。盡管如此,它的公共健康的意義很大。因為朊粒在常規消毒情況下是不被滅活的。這類患者的朊粒會通過輸血、手術或其他途徑把病原傳給他人,加上疾病發病的潛伏期長,很難馬上被發現,給臨床診斷造成很大困難。目前診斷主要限于臨床表現及晚期的影像檢查和組織學檢查,特異性也比較低。早期和主動的、特異性的診斷方法一直是此領域的熱點和亟待攻克的難題。近年來,克雅二氏病的研究和診斷有很大進展,因此,對目前國內外關于克雅二氏病的研究和診斷作一綜述,特別是目前在世界少數國家出現的Real-time quaking-induced conversion(簡稱RT-QuIC,此處翻譯為“實時震動誘導轉化”)作了詳細介紹。

克雅二氏病;朊粒;實時震動誘導轉化;診斷

1 朊粒類疾病

朊粒類疾病(prion diseases)通常稱之為傳染性海綿狀腦病(transmissible spongiform encephalopathies,TSE)。是一類人和動物均能患病的疾病。但在不同種屬上有不同的名稱,如我們熟知的瘋牛病(mad cow disease)是牛所患的一種朊粒類疾病,而在羊身上就叫瘙癢癥(scrapie)[1]。在人類中朊粒類疾病有多種,象散發型CJD(sporadic CJD,最常見),醫源型CJD(Iatrogenic CJD),家族型CJD,惡性家族型失眠癥(fatal familial insomnia,FFI)等[2]。河南是在中國發現首例FFI的省份,對中國朊粒類疾病的研究做出了重要貢獻。目前公認所有朊粒類疾病都是由朊蛋白(prion protein,Pr P)的構相異常(misfolding)造成的朊蛋白凝集和纖維化,使中樞神經細胞中毒和死亡,并使大腦組織形成空泡樣病變[3]。具體的發病機制細節尚待研究。CJD的臨床癥狀主要是患病個體的快速的記憶缺失和運動失常,不久即死亡。因疾病的潛伏期較長,病史不易追蹤,又容易與其他常見的神經變性型疾病混淆,從發病到死亡時間又較短,臨床上難以做出明確的診斷。

2 CJD

CJD是朊粒類疾病在人類中最常見的表現,最早由兩位德國醫生Creutzfeldt和Jakob在上世紀二十年代發現,但當時他們尚未把病因搞清楚。直到上世紀八十年代,prion(朊粒,源于proteinaceous infectious particle,蛋白類傳染顆粒)被諾貝爾獎獲得者Stanley B.Prusiner發現,并證明是引起CJD的病原。根據傳染途徑和基因分析,目前把CJD分為以下幾種:iatrogenic CJD(iCJD,醫源性CJD),是由于患者因使用過含有prion的生物制劑,或經過外科器械消毒不善的手術操作傳染而得病(prion不宜在常規消毒下滅活)[4];variant CJD(vCJD,CJD變種),是經牛的prion發病的,如在瘋牛病區域生活過或吃過瘋牛病病牛的肉,這個媒體報道最多,但患病者極少。中國沒有發現瘋牛病,也沒有vCJD的報道。另外還有朊粒蛋白基因PRNP基因異常造成的家族型或基因型CJD(fCJD或gCJD)。但CJD最常見的種類是sporadic CJD(sCJD,散發型CJD),占所有CJD的80～90%,發病率為百萬分之一到二,是非遺傳性的,散發性的朊粒類疾病,由PNRP基因突變,或正常的prion蛋白不明原因的自動轉化造成的CJD。惡性家族型失眠癥(fatal familial insomnia, FFI)也是PRNP基因異常造成的遺傳性疾病[5]。

3 CJD的常規研究和診斷方法

因CJD和其他朊粒造成的疾病被一致認為都是由朊粒所致,CJD的研究和診斷大都集中在朊粒上。朊粒實際上是一種正常的細胞編碼的朊蛋白(通稱Pr Pc,Cell type Pr P,細胞型朊蛋白)變構形成的具有極強傳染性和抵抗力的搔癢病朊蛋白(PrPsc, Scrapie type Pr P,因最早發現于羊搔癢癥)。這種變構的機制尚不十分清楚,但這種現象十分明顯,而且體外就可以模擬。變構后的蛋白由以α螺旋為主要結構的Pr Pc變為以β片層為主要結構的PrPsc。Pr Psc對蛋白酶酶消化極不敏感,可用免疫印跡法(Western blotting)在患病腦組織中證實并用于CJD的最終診斷和分類[3],見圖1。

圖1 兩例散發型CJD(S)和一例CJD變種(V)腦組織在免疫印跡測試中的不同表現。D為雙糖基化,M為單糖基化,N為無糖基化條帶。1,2A,2B為按條帶對CJD的分型。(摘自參考文獻3)。

另外,因CJD的主要病理表現是腦組織的空泡樣病變及prion蛋白沉積,組織學檢查腦組織以確診是非常必要的。除空泡樣病變外,造成的蛋白凝集和纖維化也可以作為診斷的依據[3],見圖2。

圖2 CJD腦組織中的點狀朊粒蛋白沉集(摘自參考文獻3)。

隨著對CJD研究的深入,發現基因突變在CJD中很普遍,基因和分子生物學檢測(如PCR)也可作為CJD診斷和分類的依據[5],見圖3。

圖3 人類朊粒蛋白基因序列變化造成的氨基酸變化一覽。其中M129V(129位的氨基酸methionine變成valine)較常見(摘自參考文獻5)。

CJD的臨床表現并不完全一致,一般來講患者的臨床表現有進展性、致命性腦病變的癥狀和體征,象記憶力缺失,小腦型失調和震顫,錐體和錐體外表現等。sCJD患者大都年齡比較大(平均年齡65歲),病期短(平均4 mon即死去),而vCJD平均年齡較小(26歲),病期稍長(平均13 mon死去)。另外在診斷CJD時遺傳和家族史也可以作為參考。這類患者的腦電圖有典型特征(每秒出現一次三期復合圖形)。利用腦部的特殊影像方法,如DWI(Diffusion-weighted imaging)或FLAIR(Fluid attenuation inversion recovery),可看到大腦皮層和基底節的病變[6-7]。根據上述臨床特征和檢查結果,可作出疑似CJD的診斷。如有組織學、免疫學和基因學的證據,可作出CJD的診斷。不難看出這些診斷方法大都限于患者晚期甚則患者死亡后。利用腦組織做診斷也受到許多限制,再加上朊粒具有極強的傳染性,腦組織的檢查和操作要求也非常慎重。同樣,因基因突變的表現非常多樣和復雜,基因學檢查實施起來也不是立竿見影,對不常見的基因突變,一下子能找到基因突變的位置也比較困難。

近些年,臨床上根據CJD發病造成的的快速腦組織病變的特點,利用腦脊液的多種生物標志物的變化作為CJD診斷的輔助證據,如蛋白tau,14-3-3和S100都會發生不同的量的變化,可以用酶聯免疫或免疫印跡法檢測[8-10],其中14-3-3應用較廣泛,在CJD發病中被破壞的細胞釋放到腦脊液中的量增加,其結果也較可靠。腦脊液的樣品收集要比腦組織容易得多,可在活體患者上收集,是一大優點,但這些生物標志物的檢測和采取的手段中很難找到特異性最強的Pr Psc,目前它們只能和臨床表現、腦電圖以及放射影像學診斷一起作為輔助診斷的依據[10-11]。

我國的CJD監測網絡已初步形成,由中國CDC統一負責和領導,監測網絡已包括中國的大部分省份[12-14]。診斷指標包括臨床檢查及實驗室檢查。14-3-3檢測已作為常規。我國克雅氏病的基礎研究居世界前列[15-16]。

4 朊粒類疾病及CJD的研究和診斷進展

為增加朊粒類疾病及CJD檢測的敏感性和特異性,近些年來出現了Protein-Misfolding Cyclic Amplification(PMCA,此處翻譯為“蛋白變構循環擴大法”)。見圖4A、B所示。

圖4 蛋白變構循環擴大法(PMCA)。A為操作示意,B為潛在原理(摘自參考文獻17)。

PMCA是利用CJD患者大腦組織勻漿,與不含有具有傳染性朊粒的正常腦組織或合成的正常細胞型朊蛋白進行孵育,并進行循環式的超聲震蕩,這樣正常的蛋白就會被轉化成對蛋白酶抵抗的朊粒蛋白,這些朊粒蛋白產物能接著轉化其他的正常構象的朊蛋白[17]。這樣朊蛋白在多輪震蕩后會越產越多,多到可以用免疫印跡法檢測。因此方法有巨大的放大作用,極少量的腦組織就可放大并產生出用免疫印跡法很容易檢測到的蛋白酶抵抗蛋白。目前此方法已趨于成熟,但它本身操作起來不是很容易,通量也不夠,常規檢測受到巨大限制。因為要取得結果需要反復用超聲震蕩,并最終用免疫印跡去證實。后來有人把正常腦組織換成重組的細胞型Pr P蛋白,對PMCA改善了不少,但超聲震蕩和最終用免疫印跡法做診斷仍使此方法的通量和動態學觀察受到限制。利用患病的腦組織作為反應的“種子”(seeds)在動物朊粒類疾病診斷上較可行,可在人身上發生的CJD的診斷上要活體采樣,安全和操作難度很大。

幾年前以美國國家衛生研究院(NIH)為代表的的研究團隊對朊粒類疾病及CJD檢測有突破性進展,他們利用倉鼠朊粒疾病模型263K腦勻漿為“種子”,用快速振勻法替代超聲震蕩,并使用大腸桿菌人工表達的倉鼠細胞型朊蛋白作為“底物”(substrate),在含有多孔的振勻器(shaker)上操作,這樣一次檢測就可測試多個樣品,這樣自動化較高的振勻器替代了超聲震蕩。他們把此方法叫做quaking-induced conversion(簡稱QuIC,“震動誘導轉化”)。雖然免疫印跡法仍作為最終的診斷結果,但此方法與PMCA比較有巨大改善,見圖5。

圖5 震動誘導轉化示意圖(摘自參考文獻17)。

NIH團隊不久就對QuIC作了進一步的改進,他們用具有快速振勻功能的多孔板釋讀器(plate reader)代替了振勻器,并利用朊蛋白沉淀小體(amyloid)在形成過程中能吸收顏料thioflavin T并造成光譜吸收的變化的現象,在QuIC反應中加入thioflavin T,并用釋讀器實時監測熒光吸收變化[17-18],見圖6。他們把此方法稱之為“實時震動誘導轉化”(Real-time quaking-induced conversion)。因此方法省去了免疫印跡,又能在96孔板上測試,不需要超聲震蕩(自動定時快速振勻即可),操作上簡便了許多,通量也提高了。NIH團隊后來利用倉鼠腦脊液作為“種子”,取代了腦組織勻漿,成功取得了RT-QuIC的測試成功[18],這提示了腦脊液可以作為檢測樣品,并為這個方法的臨床應用提供了科學依據。他們也報道了倉鼠嗅覺神經能向鼻腔散播朊粒,并可用RT-QuIC

圖6 實時震動誘導轉化示意(摘自參考文獻17)。

檢測鼻腔分泌物證實朊粒的存在[19]。后來的澳大利亞和英國的科學家利用了腦脊液作為“種子”,利用合成的倉鼠蛋白作為底物,應用于不同類的克雅氏病患者樣品的測試,取得了初步的成功[20-21]。目前RTQuIC被公認是最有希望的檢測克雅氏病的方法,具有很高的靈敏度和特異性。目前多個國家正在努力使此方法標準化。此方法的關鍵是拿到功能性強,純度又高的Pr P,這對容易沉淀和凝集的PrP來說是一個挑戰,但相信通過大家共同努力,一個特異性高、敏感性強的克雅氏病的診斷方法將誕生。

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[責任編輯 段金卯]

Progress in the study on and diagnosis of Creutzfeldt-Jakob Disease（CJD）

HE Min1，2，CHEN Wenwu3，CHENG Keding3，JI Xinying1，3*
（1.Henan Provincial Key Laboratory for Antibody Drug Engineering，Kaifeng，Henan 475004，China；2. Henan Provincial Vocational College for Nursing，Anyang，Henan 455000，China；3.The First Affiliated Hospital，Henan University，Kaifeng，Henan 475001，China）

Creutzfeldt Jakob disease（CJD）is the most common type of disease caused by prion.Different from other type of infectious diseases，this disease is caused by pathogens that contain genetic elements，such as viruses or bacteria.It is caused directly by a deformed protein called prion.Even so，the disease has important impact in public health，since prion can't be destroyed in routine sterilization procedures.The prion from CJD patients can be transferred through blood transfusion，surgery，and other approaches.The disease has a long latent phase，and is hard to be identified.This causes a big problem in clinical diagnosis.The current diagnosis involves clinical signs，imaging，and histology with low specificity.Early and active diagnosis with high specificity is urgently needed. There are some big developments in the diagnosis of CJD in recent years.This paper summarizes the progress in this area domestically and internationally，especially the recently developed real time quaking induced conversion（RTQuIC）in details.

Creutzfeldt Jakob disease（CJD）；prion；realtime quaking induced conversion（RTQuIC）；prion disease diagnosis

R749.1

A

1672-7606(2014)02-0145-05

2014-09-12

何敏(1964-),女,河南林州人,副教授,從事分子生物學教學與科研工作。

*通訊作者:姬新穎(1963-),男,河南開封人,博士,教授,碩士生導師,從事分子生物學教學與科研工作。