HS014對嗎啡耐受大鼠脊髓組織OX-42、TNF-α表達的影響及意義

徐紅梅，牛澤軍，褚海辰

(青島大學附屬醫院，山東青島266003)

阿片類藥物是緩解中重度疼痛最常用的藥物，慢性疼痛常需要長期應用阿片類藥物，但反復應用該類藥物易導致鎮痛耐受［1］，耐受的細胞和分子生物學機制目前仍不清楚。近年來研究證實，脊髓小膠質細胞［2～4］、神經炎癥［4～6］以及黑皮質素受體系統［7～9］在嗎啡耐受形成和調節中具有重要作用;黑皮質素受體在腦和脊髓分布廣泛，且在脊髓膠質細胞也有表達［10，11］。我們于2009年1月 ～2012年12月進行本研究，探討黑皮質素受體拮抗劑(HS014)對嗎啡耐受大鼠脊髓組織OX-42及腫瘤壞死因子α(TNF-α)表達的影響及意義。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠30只，體質量220～250 g，由青島市藥物研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及處理方法 將大鼠隨機分為5組，每組6只。嗎啡耐受組(M組):腹腔注射鹽酸嗎啡注射液，10 mg/(kg·次)、2次/d，注射時間分別為8:00 am和5:00 pm，連續給藥5 d。生理鹽水組(N組):腹腔注射相同體積的生理鹽水，其余處理及方法均同M組。HS014+嗎啡組(HM組):大鼠每天第2次(5:00 pm)腹腔注射鹽酸嗎啡注射液前 15 min 鞘內置管注射(方法見 1.2.2)5 μg HS014，其余處理及方法均同M組。生理鹽水+嗎啡組(NM組):大鼠每天第2次(5:00 pm)腹腔注射鹽酸嗎啡注射液前15 min鞘內注射5 μL生理鹽水，其余處理及方法均同M組。HS014+生理鹽水組(HN 組):大鼠腹腔注射生理鹽水，5 μL/次、2次/d，注射時間分別為8:00 am和5:00 pm，每天第2次腹腔注射生理鹽水前15 min鞘內注射HS014 5 μg，連續給藥5 d。大鼠痛閾值與基礎值沒有差異被認為嗎啡耐受形成。

1.2.2 鞘內置管 根據 Yaksh等［12］方法，大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液400 mg/kg;充分麻醉后，于后枕部正中線切開皮膚，鈍性分離頸部肌肉，充分暴露寰枕膜;用22 G注射器針頭輕輕刺破寰枕膜，可見清亮腦脊液流出;由此輕柔置入，術前充滿無菌水的無菌聚乙烯管(PE-10:OD 0.5 mm，ID 0.25 mm)至大鼠脊髓腰膨大處(深度為7～8cm);導管置入后立即緩慢注射10 μL 0.9%NaCl;封閉導管外口，固定導管;以4-0手術線分層縫合肌肉與皮膚。術后出現后肢癱瘓、運動功能障礙的大鼠均剔除實驗。接受置管的大鼠，術后至少恢復1周。

1.2.3 脊髓標本制作 各組大鼠于第5天實驗結束后，用10%水合氯醛溶液(400 mg/kg)充分麻醉后迅速打開胸腔，暴露心臟和升主動脈;將針頭從心臟左心室插入直到升主動脈，剪開右心耳，先用生理鹽水快速灌注，待右心耳流出的液體變為淡紅色，繼續以含4%多聚甲醛的0.1 mol/L PBS(pH 7.2)500 mL灌注固定30～60 min。沿坐骨神經向上分離至大鼠脊髓處，定位L4～6段脊髓;用骨鉗小心咬開椎板，取出L4～6段脊髓，在4℃、4%多聚甲醛溶液中固定過夜至組織塊沉底;取腰膨大處標本，置于10%中性甲醛固定液中固定12 h，然后以0.1 mol/L PBS液洗滌3次(共120 min)。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟浸潤包埋成蠟塊，切片機連續5 μm橫斷面切片，置于0.01 mol/L PBS內備用。

1.2.4 脊髓組織OX-42、TNF-α 檢測 采用免疫組織化學法，步驟參照試劑盒說明書。每只大鼠取連續5個脊髓切片，于Olympus數字顯微鏡系統(×400)下觀察，每張切片隨機選取3個視野進行數碼拍照，應用專業圖像分析軟件(Image pro-Plus 6.0)對OX-42、TNF-α陽性細胞進行計數。

1.2.5 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件。計量資料以±s表示，組間、組內比較采用方差分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

各組大鼠脊髓組織OX-42、TNF-α陽性細胞數比較見表1。

表1 各組大鼠脊髓組織OX-42、TNF-α陽性細胞數比較(個，±s)

表1 各組大鼠脊髓組織OX-42、TNF-α陽性細胞數比較(個，±s)

注:與 N組比較，*P ＜0.01;與 M 組比較，△P ＜0.01

組別 n OX-42陽性細胞 TNF-α陽性細胞N組6 12.20±1.99 28.40±1.14 M 組 6 31.90±3.03* 99.30±2.12*HM 組 6 23.10±2.33＊△ 61.00±1.28＊△NM 組 6 32.00±1.89* 92.60±1.43*HN組6 12.50±1.58 26.10±0.85

3 討論

慢性應用嗎啡能夠誘導膠質細胞激活［2～4，13］，并能夠增加促炎細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表達［5，6］，即促炎細胞因子的釋放正是膠質細胞激活的結果［4，14］。激活的膠質細胞能夠釋放促炎細胞因子和其他神經興奮性物質，拮抗嗎啡的鎮痛作用，易化疼痛，引起嗎啡耐受［2，4，6，14］。釋放的促炎細胞因子也可通過旁分泌的形式作用于遠程細胞，使疼痛相關的遞質和調質如興奮性氨基酸(EAA)、NO、前列腺素(PGs)等從初級傳入末端釋放［15］，或直接作用于神經元和其他受體系統，促進嗎啡耐受形成。而聯合給予膠質細胞代謝抑制劑、細胞因子拮抗劑、IL-10或IL-1受體拮抗劑(IL-1ra)，能夠維持嗎啡的鎮痛作用，抑制促炎細胞因子的產生，從而抑制嗎啡耐受、痛覺過敏和異常性疼痛的形成［4，6，13，16］。應用其他膠質細胞抑制劑也得到相同結果。米諾環素和己酮可可堿通過降低小膠質細胞標志物CD11b/c蛋白水平，抑制嗎啡耐受的發生;此外，兩種藥物抑制嗎啡耐受的作用也與減少 IL-6、TNF-α、IL-1β的產生和興奮 IL-10 相關。Tai等和 Mika等研究［5，17］也證實，慢性嗎啡耐受能誘導興奮性氨基酸(天冬氨酸和谷氨酸)水平顯著增加，IL-6、TNF-α、IL-1β 表達增加，谷氨酸轉運體GLAST、GLT-1和EAAC1表達下調，而聯合給予阿米替林能防止和減弱嗎啡的耐受作用;其作用機制可能是抑制促炎因子的表達，阻斷谷氨酸轉運體下調，甚至上調膠質細胞谷氨酸轉運體(GLAST和GLT-1)的表達，減弱嗎啡誘導的EAA釋放。Johnston等［18］也證實，嗎啡耐受能夠增加促炎細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達，并且IL-1β能抑制嗎啡的鎮痛作用，從而促進嗎啡耐受的形成，而抑制促炎細胞因子的產生能夠恢復阿片類藥物的鎮痛作用［19］。

本研究結果表明，腹腔內給予嗎啡可誘導大鼠產生嗎啡耐受，在此過程中，脊髓小膠質細胞被激活，表現為OX-42表達顯著增加，并釋放大量TNF-α;黑皮質素受體拮抗劑HS014能夠減輕嗎啡耐受，機制可能與其抑制嗎啡引起的小膠質細胞激活及TNF-α釋放有關，但其調節神經炎癥反應的確切機制仍有待進一步研究。

［1］Ossipov MH，Lai J，King T，et al.Antinociceptive and nociceptive actions of opioids［J］.J Neurobiol，2004，61(1):126-148.

［2］Lin SL，Tsai RY，Shen CH，et al.Co-administration of ultra-low dose naloxone attenuates morphine tolerance in rats via attenuation of NMDA receptor neurotransmission and suppression of neuroinflammation in the spinal cords［J］.Pharmacol Biochem Behav，2010，96(2):236-245.

［3］Cui Y，Chen Y，Zhi JL，et al.Activation of p38 mitogen-activated protein kinase in spinal microglia mediates morphine antinociceptive tolerance［J］.Brain Res，2006，1069(1):235-243.

［4］Watkins LR，Hutchinson MR，Johnston IN，et al.Glia:novel counter-regulators of opioid Analgesia［J］.Trends Neurosci，2005，28(12):661-669.

［5］Tai YH，Wang YH，Wang JJ，et al.Amitriptyline suppresses neuroinflammation and up-regulates glutamate transporters in morphinetolerant rats［J］.Pain，2006，124(1-2):77-86.

［6］Lin SL，Tsai RY，Tai YH，et al.Ultra-low dose naloxone upregulates interleukin-10 expression and suppresses neuroinflammation in morphine-tolerant rat spinal cords［J］.Behav Brain Res，2010，207(1):30-36.

［7］Starowicz K，Sieja A，Bilecki W，et al.The effect of morphine on MC4 and CRF receptor mRNAs in the rat amygdala and attenuation of tolerance after their blockade［J］.Brain Res，2003，990(1-2):113-119.

［8］Starowicz K，Obara I，Przewlocki R，et al.Inhibition of morphine tolerance by spinal melanocortin receptor blockade［J］.Pain，2005，117(3):401-411.

［9］Kalange AS，Kokare DM，Singru PS，et al.Central administration of selective melanocortin 4 receptor antagonist HS014 prevents morphine tolerance and withdrawal hyperalgesia［J］.Brain Res，2007(1181):10-20.

［10］Selkirk JV，Nottebaum LM，Lee J，et al.Identification of differential melanocortin 4 receptor agonist profiles at natively expressed receptors in rat cortical astrocytes and recombinantly expressed receptors in human embryonic kidney cells［J］.Neuropharmacology，2007，52(2):459-466.

［11］Caruso C，Durand D，Schi?th HB，et al.Activation of melanocortin 4 receptors reduces the inflammatory response and prevents apoptosis induced by lipopolysaccharide and interferon-gamma in astrocytes［J］.Endocrinology，2007，148(10):4918-4926.

［12］Yaksh TL，Rudy TA.Chronic catheterization of the spinal subarachnoid space［J］.Physiol Behav，1976，17(6):1031-1036.

［13］Song P，Zhao ZQ.The involvement of glial cells in the development of morphine tolerance［J］.Neurosci Res，2001，39(3):281-286.

［14］Tsai RY，Jang FL，Tai YH，et al.Ultra-low-dose naloxone restores the antinociceptive effect of morphine and suppresses spinal neuroinflammation in PTX-treated rats［J］.Neuropsychopharmacology，2008，33(11):2772-2782.

［15］Watkins LR，Millogan ED，Maier SF.Glial proinflammatory cytokines mediate exaggerated pain states:implications for clinical pain［J］.Adv Exp Med Biol，2003(521):1-21.

［16］Raghavendra V，Rutkowski MD，DeLeo JA.The role of spinal neuroimmune activation in morphine tolerance/hyperalgesia in neuropathic and sham-operated rats［J］.J Neurosci，2002，22(22):9980-9989.

［17］Mika J，Wawrzczak-Bargiela A，Osikowicz M，et al.Attenuation of morphine tolerance by minocycline and pentoxifylline in na?ve and neuropathic mice［J］.Brain Behav Immun，2009，23(1):75-84.

［18］Johnston IN，Milligan ED，Wieseler-Frank J，et al.A role for proinflammatory cytokines and fractalkine in analgesia，tolerance，and subsequent pain facilitation induced by chronic intrathecal morphine［J］.J Neurosci，2004，24(33):7353-7365.

［19］Raghavendra V，Tanga FY，De Leo JA.Attenuation of morphine tolerance，with drawal-induced hyperalgesia，and associated spinal inflam-matory immune responses by propentofylline in rats［J］.Neuropsychopharmacology，2004，29(2):327-334.