GSTT 1基因多態性及吸煙與胃癌的關系

史劍權 駱寶建 劉榮英 陳言東

1.首都醫科大學附屬北京胸科醫院重癥醫學科，北京 101149；2.包頭醫學院第二附屬醫院，內蒙古 包頭 014030

胃癌（gastric cancer，GC）的發生是一個多因素、多階段的過程，它與環境致癌物、個體的遺傳易感性等因素密切相關，因此，與環境致癌物代謝有關的代謝酶（包括GST家族、CYP家族等）基因多態性的問題成了當前腫瘤研究的一個重要方向。GSTT1作為谷胱甘肽 S-轉移酶 （glutathione-s-transferase，GSTs，EC2.5.1.18）家族的重要成員，其基因多態性（包括存在型和缺失型）與腫瘤的關系，也就引起了國內外學者的關注。近年來，國內外的研究報道表明GSTT1基因缺失型與肺癌[1]、肝癌[2]、胰腺癌[3]等多種腫瘤的易感性有關。關于GSTT1基因多態性與胃癌遺傳易感性方面的研究，結論尚不統一[4]。本研究中，通過研究吸煙（環境因素）和GSTT1基因多態性（遺傳因素）對胃癌發生的影響，為胃癌的病因研究以及一級預防提供依據。

1 材料與方法

1.1 標本來源

所有胃癌病例均來源于內蒙古消化病研究所（設于包頭醫學院第二附屬醫院）和包頭市腫瘤醫院。所有胃癌病例均由組織病理學檢查確診為胃癌。對照組的個體均來自于當地排除腫瘤病史的一般人群。所有標本收集的起止時間為2005年5月～2006年3月。胃癌組患者60例，男43例，女17例，年齡（55.60±8.14）歲；對照組83例，男53例，女30例，年齡（56.33±7.90）歲。胃癌組和對照組的年齡和性別比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 流行病學調查

由經過培訓的醫護人員，對所有研究對象（胃癌組和對照組）進行包括性別、年齡、吸煙情況的流行病學調查。對吸煙情況分為“不吸煙”和“吸煙”兩種。其中，“吸煙”規定為每天至少吸1支煙，持續1年以上者，達不到這一標準者規定為“不吸煙”。

1.3 主要試劑

①Taq DNA 聚和酶，dNTPs，DNA Marker，無菌去離子水均購于加拿大上海Songon生物工程技術服務有限公司。②瓊脂糖、EB、Tris、EDTA、硼酸、溴酚蘭均購于北京鼎國生物技術有限公司。③DNA提取液：由內蒙古基因診斷研究所提供。

1.4 GSTT1基因型的檢測

1.4.1 DNA的提取 取胃癌組患者及對照組的人外周血2 mL，置入加有EDTA的抗凝試管中，于半小時內置于-20℃低溫冰箱中冷凍保存或立即進行基因組DNA的提?。ㄌ崛》椒ㄓ蓛让晒呕蛟\斷中心提供）。

1.4.2 PCR擴增 應用聚合酶鏈反應PCR方法擴增基因組DNA，參照文獻[5]，構建GSTT1和β-珠蛋白基因的引物（表 1），其中，β-珠蛋白（268 bp）作為內對照。所有的引物序列均經美國生物信息中心（national center for biotechnology information，NCBI） 的序列比對工具 （basic local alignment search tool，BLAST） 的驗證，并由加拿大上海Songon生物技術有限公司合成（PAGE純化）。GSTT1基因引物序列為正義鏈5'-TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC-3'， 反 義鏈 5'-TCACCGGATCATGGCCAGCA-3'。β-珠蛋白基因引物序列為正義鏈5'-GAAGAGCCAAGGACAGGTAC-3'，反義鏈5'-CAACTTCATCCACGTTCACC-3'。PCR反應體系 15 μL，其中包括模板 DNA 3 μL，GSTT1 和β-珠蛋白的上下游引物（濃度為 25 μmol/L）各 0.3 μL、dNTP （濃度為 25 mM）0.3 μL、10×buffer 1.5 μL、Tag酶（濃度 5 U/μL）為 0.35 μL、MgCl2（濃度為 25 mM）1.3 μL、無菌去離子水 7.35 μL。上 PCR 儀，PCR 反應循環參數：95℃預變性 5 min，94℃變性 45 s，60e退火45 s，73℃延伸 45 s，共 36 個循環，最后再 73℃延伸10 min后終止擴增。

1.4.3 電泳 取PCR產物15 μL，加2 μL TEB緩沖液，3%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外燈下觀察結果。

1.5 統計學方法

所有的統計分析以及統計圖的繪制均采用SPSS 13.0軟件包。①計量資料的組間比較采用t檢驗，計數資料的組間比較采用χ2檢驗，雙側檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。②吸煙、GSTT1基因型的聯合作用與胃癌的關系采用分層分析，以比值比OR及其95%的可信區間（confidence interval，CI）表示相對危險度。

2 結果

2.1 GSTT1基因型的檢測結果

GSTT1擴增產物的大小為480 bp，內對照β-珠蛋白產物的大小為268 bp，同時出現480 bp及268 bp兩條帶者即為GSTT1基因存在型，用GSTT1（+）表示；只出現268 bp一條帶（β-珠蛋白基因）者為GSTT1基因缺失型，用 GSTT1（-）表示，見圖 1。其中，1、3、4 泳道為 GSTT1基因存在型，2、5、6泳道為 GSTT1基因缺失型，M為marker。

圖1 GSTT1和β珠蛋白基因PCR產物電泳結果

2.2 胃癌組及對照組GSTT1基因型分布的比較

分別對胃癌組60例和對照組83例進行了GSTT1基因檢測，結果表明，胃癌組GSTT1（-）例數為34 例，GSTT1（+）例數為 26 例；同時，對照組中，GSTT1（-）例數為 33 例，GSTT1（+）例數為 50 例。GSTT1 基因缺失率為56.7%（34/60），明顯高于對照組的39.8%（33/83），差異有統計學意義（χ2=3.998，P＜0.05）。攜帶GSTT1（-）基因型者發生胃癌的危險性是攜帶GSTT1（+）基因型者的 1.98 倍（OR=1.98，95%CI：1.01～3.89）。

2.3 胃癌組及對照組吸煙情況的比較

分別調查胃癌組和對照組的吸煙情況，結果發現，胃癌組中吸煙者的例數為39例，不吸煙的例數為21例；對照組中，吸煙者的例數為29例，不吸煙的例數為54例。胃癌組中吸煙者的比例為65.0%（39/60），高于對照組34.9%（29/83），組間比較差異有統計學意義（P＜0.05）。吸煙者發生胃癌的危險性是非吸煙者的 3.458 倍（OR=3.458，95%CI：1.723～6.939）。

2.4 GSTT1基因型及吸煙與胃癌的關系

2.4.1 根據是否吸煙分層分析GSTT1基因型與胃癌的關系 不吸煙人群中，胃癌組和對照組的GSTT1基因型分布差異無統計學意義（P ＞ 0.05），GSTT1（-）基因型未顯著增加不吸煙者患胃癌的風險。吸煙人群中，胃癌組和對照組的GSTT1基因型分布差異有統計學意義（P＜0.05）；并且，吸煙人群中，GSTT1缺失型的人患胃癌的風險性是GSTT1存在型的4.75倍（P=0.003，OR=4.75，95%CI：1.68～13.41），即 GSTT1（-）基因型顯著增加吸煙者患胃癌的風險。見表1。

表1 根據吸煙情況分層分析GSTT1基因型與胃癌的關系（例）

2.4.2 根據GSTT1基因型分層分析吸煙與胃癌的關系 GSTT1（+）人群中，吸煙者在胃癌組和對照組中的分布無顯著性差異（P＞0.05），吸煙未明顯增加GSTT1（+）人群患胃癌的風險。GSTT1（-）人群中，吸煙者在胃癌組和對照組中的分布差異有統計學意義（P＜0.05）；并且，GSTT1（-）人群中，吸煙者患胃癌的風險性是不吸煙者的 11.6 倍（OR=11.6，95%CI：3.516～28.266），即吸煙顯著增加GSTT1（-）人群患胃癌的風險。見表2。

表2 根據GSTT1基因型分層分析，吸煙與胃癌的關系（例）

3 討論

胃癌目前依然是導致惡性腫瘤相關死亡的第2位疾病[6]，具有發病率高、轉移率高、病死率高、早期診斷率低、5年生存率低等特點[7]，給家庭和社會帶來極大危害，因此，進行胃癌的病因學研究，篩選胃癌的易感基因和高危人群，對胃癌進行有效的一級預防（病因預防），就具有十分重要的意義。

谷胱甘肽轉硫酶是人體內一組具有重要解毒作用的多基因酶家族，屬Ⅱ相代謝酶；它參與致癌物的代謝，是體內重要的解毒機制[8]。目前，將人的胞漿型GSTs同工酶分為四種，即α、μ、π和θ，分別由不同的基因編碼。編碼GST-θ同功酶的GSTT1基因定位于人類22號染色體q11.23。GSTT1基因在人群中具有基因缺失多態性，可分為存在型GSTT1（+）和缺失型GSTT1（-），亦即一些人不具有GSTT1基因。大量研究表明，不同種族、不同地域的群體，GSTT1基因缺失型的頻率差異很大，GSTTl基因缺失型在非洲、亞洲、歐洲人群中分布頻率分別為 15%～26%、16%～64%和10%～21%[9]。本研究中，通過分析對照組，提示內蒙古地區一般人群GSTT1基因缺失頻率為39.8%。

不具有GSTT1基因的個體，由于體內GSTT1基因的缺失，導致機體不能產生有活性的GST-θ同功酶，進而不能有效去除體內親電子致癌物，這可能增加了體細胞突變的風險并最終導致腫瘤的形成[10]，所以，GSTT1基因多態性可能與癌癥易感性有關。本實驗中，胃癌組GSTT1基因缺失率為56.7%，顯著高于對照組的39.8%，差異有統計學意義（P＜0.05）。攜帶GSTT1（-）基因型者發生胃癌的危險性比 GSTT1（+）者明顯升高（OR=1.98，95%CI：1.01～3.89），提示GSTT1基因缺失型是胃癌的易感基因型。這與Palli等[11]、Zhao 等[12]學者的結論一致；但同時 Nguyen 等[13]、García-González等[14]報道胃癌組和對照組GSTT1基因型頻度分布的差異無顯著性。國外另一項Meta分析的結果顯示[15]，GSTT1基因多態性對不同種族人群胃癌易感性的作用不同：在白種人中GSTT1缺失增加患胃癌風險，在黃種人中GSTT1缺失未增加患胃癌風險。不同作者報道不同種族、不同地區GSTT1基因多態性與胃癌易感性關系的研究結果的不一致，其原因是多方面的：不同地區、不同種族人群中環境因素、生活習慣、遺傳特征的差異；胃癌是多種基因、多種環境因素長期相互作用的結果，某種致癌的環境因素可能會掩蓋個體GSTT1基因缺失在胃癌發病過程中所起的作用；不同研究中樣本選擇、樣本量大小、研究方法的差異。

煙草燃燒所產生的煙霧中，至少有43種為已知的致癌物[16]，吸煙是一種公認的致癌因素。本研究中，胃癌組的吸煙率明顯高于對照組（P＜0.05），吸煙者相對非吸煙者，患胃癌的風險顯著上升（OR=4.75），吸煙是胃癌的危險因素之一，這與Nomura等[17]的觀點一致。同時，GSTT1編碼的GST-θ同工酶在煙草中的致癌物：乙烯氧化物、環氧丁烷、烴類氧化物的解毒第二時相發揮作用，所以，GSTT1編碼的酶的缺失將可能導致煙草中的有害致癌物的解毒障礙，增加相應人群致癌的危險性。近年來，代謝酶系基因多態性、吸煙與腫瘤易感性相互關系的研究備受關注。本研究中，通過兩組分層分析（見表1、2）可看出：①GSTT1（-）基因型未明顯增加不吸煙人群患胃癌的風險（P＞0.05）；但GSTT1（-）基因型會顯著增加吸煙人群患胃癌的風險（OR=4.75，95%CI：1.68～13.41）。②吸煙未明顯增加GSTT1（+）人群患胃癌的風險性（P＞0.05）；但吸煙會顯著增加GSTT1（-）人群發生胃癌的風險（OR=11.6，95%CI：3.516～28.266）。GSTT1（-）基因型且吸煙的人，患胃癌的風險明顯提高。GSTT1缺失基因型和吸煙協同作用，共同增加發生胃癌的風險。

總之，本研究認為，胃癌的發生涉及到多種環境因素及遺傳因素長期的相互作用。在內蒙古地區，GSTT1缺失基因型是胃癌的易感基因型，吸煙是胃癌的危險因素之一，吸煙和GSTT1（-）基因在胃癌的發生中有協同作用。對于GSTT1基因缺失的這類胃癌的高危人群，應特別加強教育，使其改善生活習慣，盡量杜絕主動吸煙和被動吸煙，定期體檢，預防胃癌的發生。

[1]Dzian A，Halasova E，Matakova T，et al.Lung adenocarcinoma and squamous cell carcinoma in association with genetic polymorphisms of GSTs in Slovak population[J].Neoplasma，2012，59（2）：160-167.

[2]Chen J，Ma L，Peng NF，et al.Relationship between GSTT1 gene polymorphism and hepatocellular carcinoma in patients from China[J].Asian Pac J Cancer Prev，2012，13（9）：4417-4421.

[3]Bu X，Zhao C.Significant association between GSTT1 null genotype and susceptibility to pancreatic cancer[J].Mol Biol Rep，2013，40（7）：4295-4299.

[4]曹亞.腫瘤學[M].2版.北京：人民衛生出版社，2003：24.

[5]Srivastava DS，Mandhani A，Mittal B，et al.Genetic polymorphism of glutathione S-transferase genes （GSTM1，GSTT1 and GSTP1）and susceptibility to prostate cancer in Northern India[J].BJU Int，2005，95（1）：170-173.

[6]聞旭陽，戴廣海.hMLH1基因啟動子CpG島甲基化，微衛星不穩定與胃癌[J].中國醫藥導報，2011，8（7）：9-11.

[7]陳玉敏，王金林，師鎖江，等.胃癌患者外周血中CK-19的表達及其臨床意義[J].中國醫藥導報，2013，10（14）：4-6.

[8]張力為，伊力亞爾·夏合丁，吳明拜，等.致癌物代謝酶基因（CYP2C19、GSTT1）多態性與哈薩克族人群食管癌發病風險關系的研究[J].實用腫瘤雜志，2009，24（3）：232-236.

[9]Cotton SC，Sharp L，Little J，et al.Glutathione S-transferase polymorphisms and colorectal cancer a HuGE review[J].Am J Epidemiol，2000，151（1）：7-32.

[10]王雪峰，戴路明，張繼先.Ⅰ、Ⅱ相代謝酶基因多態性與肺癌遺傳易感性研究進展[J].臨床肺科雜志，2008，13（9）：1162-1164.

[11]Palli D，Saieva C，Gemma S，et al.GSTT1 and GSTM1 gene polymorphisms and gastric cancer in a high-risk italian population[J].Int J Cancer，2005，115（2）：284-289.

[12]Zhao Y，Luo Y，Huang B，et al.GSTT1 null genotype contributes to increased risk of gastric cancer in Chinese population：evidence from a meta-analysis[J].Tumour Biol，2013，34（3）：1691-1697.

[13]Nguyen TV，Janssen MJ，van Oijen MG，et al.Genetic polymorphisms in GSTA1，GSTP1，GSTT1，and GSTM1 and gastric cancer risk in a Vietnamese population[J].Oncol Res，2010，18（7）：349-355.

[14]García-González MA，Quintero E，Bujanda L，et al.Relevance of GSTM1，GSTT1，and GSTP1 gene polymorphisms to gastric cancer susceptibility and phenotype[J].Mutagenesis，2012，27（6）：771-777.

[15]Saadat M.Genetic polymorphisms of glutathione S-transferase T1 （GSTT1）and susceptibility to gastric cancer：a meta-analysis[J].Cancer Sci，2006，97（6）：505-509.

[16]王辰，肖丹，孫永昌，等.中國臨床戒煙指南（2007年版，試行本）[J].國際呼吸雜志，2008，28（16）：961-970.

[17]Nomura AM，Wilkens LR，Henderson BE，et al.The association of cigarette smoking with gastric cancer：the multiethnic cohort study[J].Cancer Causes Control，2012，23（1）：51-58.