亞硫酸氫鹽在SPORL法預處理稻草中的作用

李 洲 王高升,* 王 霞 肖 林 夏蕊蕊

(1.天津科技大學天津市制漿造紙重點實驗室,天津,300457；2. 山東龍力生物科技股份有限公司,山東省秸稈生物煉制技術重點實驗室,山東德州,251200)

面對日益嚴重的能源危機,利用來源豐富、廉價且可再生的植物纖維原料生產燃料乙醇是一條解決能源問題的有效途徑[1]。植物纖維原料主要由纖維素、半纖維素和木素等組成,利用纖維素水解得到的葡萄糖發酵生產乙醇是目前制備纖維素乙醇的主流技術。由于木素和半纖維素對纖維素的包裹以及纖維素本身的復雜結構，對植物纖維直接進行酶水解時,其水解程度很低,一般只有10%～20%。只有經過有效預處理,破壞植物纖維的復雜結構,增加纖維素酶對纖維素的可及度,才能使植物纖維原料被充分利用。因此,預處理是利用植物纖維原料生產燃料乙醇的關鍵技術。研究開發高效、低成本的預處理技術是植物纖維原料生產燃料乙醇的主要方向之一。目前,開發了許多預處理技術,并取得了一些成果。這些預處理技術可分為物理法、化學法、物理化學法和生物法,基本原理都是去除木素和半纖維素,破壞原料的物理結構,降低纖維素結晶度和聚合度。研究較多的方法有蒸汽爆破法(Steam Explosion)[2]、 稀酸法(Dilute Acid)[3]、 有機溶劑法(Organosolv)[4]、 氨氣爆破法(AFEX)[5]、 堿法(Alkaline)[6]、 熱水法(Hot Water)[7-8]、 替代溶劑預處理(Alternative Solvents Pretreatment)[9-11]、 生物預處理(Fungal Pretreatment)[12]等。這些方法都存在各自的缺點,主要有以下幾個方面：①氨氣爆破法、稀酸法、熱水法對原料的適應性差,通常對木素含量低的農業廢棄物有效,但對木素含量高的針葉木效果不理想；②稀酸法、蒸汽爆破法會產生發酵抑制物，如糠醛含量高；③石灰法和真菌預處理的處理時間長；④蒸汽爆破法大規模生產時存在障礙，如缺少適合大規模生產的設備；⑤替代溶劑預處理的原材料價格高；⑥稀酸法的反應器需要特種耐腐蝕金屬材料；⑦經熱水法、氨氣爆破法預處理后，半纖維素水解為寡糖,需要利用酶或酸將寡糖進一步水解成單糖。

SPORL(Sulfite Pretreatment to Overcome Recalcitrance of Lignocellulose)法預處理是近年來開發出的一種預處理方法，主要利用酸性亞硫酸氫鹽對植物纖維原料進行預處理,以克服植物纖維原料對酶的抗性。目前的研究表明,SPORL法對于多種生物質原料(如云杉、紅松、桉木、楊木、麥草、棉稈和玉米秸稈等)有很好的適應性,提高了纖維素酶水解效率[13-19]。

我國是世界第一秸稈大國,我國秸稈總產量占全球秸稈總產量的17.3%,每年可收集到的纖維秸稈資源量為3.0億～3.3億t,其中約1.0億t為稻草[20]。近年來,由于秸稈產量的增加，農村產業結構和能源結構的改變,各類替代物品的應用,以及秸稈分布零散、體積大、收集運輸成本高、綜合利用經濟性差和產業化程度低等原因,秸稈出現了地區性、季節性和結構性過剩,大量秸稈資源浪費嚴重。目前,我國的稻草、玉米秸稈和麥草都有不同程度的過剩問題,尤其是稻草過剩最多。稻草是我國主要農作物秸稈,年產量占全國秸稈總產量的25%，主要分布于我國南方地區和東北地區。由于稻草硅含量較高,導致其在造紙工業中的應用較少。本實驗采用SPORL法預處理稻草,考察亞硫酸氫鹽用量對稻草酶水解效果的影響,為進一步研究SPORL法預處理機理和充分利用稻草資源打下基礎。

1 實 驗

1.1材料

實驗所用稻草產自江蘇省常州市,使用時先將稻草切成2～3 cm的草段,過篩以去除雜質。纖維素酶由青島蔚藍生物股份有限公司提供,濾紙酶活為165.2 U/g。實驗所用鹽酸四環素、亞硫酸氫鈉、間苯三酚、冰醋酸、濃硫酸、鹽酸等均為分析純。

1.2實驗方法

1.2.1SPORL法預處理

稱取100 g絕干稻草并與預處理藥液混合均勻后置于1 L反應罐內,密封并裝入電熱蒸煮鍋(ZQS1電熱蒸煮鍋,陜西科技大學機械廠)內,每次實驗可以同時裝載4個1 L反應罐。在預定溫度、時間、固液比等條件下進行SPORL法預處理。預處理完畢,分離固相與液相,液相離心后用pH計測定pH值,并收集到試劑瓶中用于后續分析；固相(預處理稻草)經疏解分散、洗凈并甩干后,貯于密封袋中,在4℃下冷藏儲存備用。

1.2.2預處理稻草酶水解

稱取2 g絕干預處理稻草并置于100 mL三角瓶中,加入50 mL HAc-NaAc緩沖液(pH值4.8、濃度0.1 mol/L),纖維素酶用量為7.5 U/g(對絕干預處理稻草),同時加入0.4 mL質量濃度為10 g/L的鹽酸四環素溶液,補加蒸餾水至100 mL。酶水解溫度50℃、搖床轉速200 r/min,在酶水解72 h時取400 μL水解液于離心管中,煮沸使纖維素酶失活，然后用微量高速離心機在10000 r/min的轉速下離心10 min,取上清液測定葡萄糖濃度。

1.2.3測定方法

按照GB/T2677.2—2011、GB/T2677.8—1994、GB/T10337—2008、GB/T742—2008分別測定水分、酸不溶木素含量、酸溶木素含量及灰分；采用山東省科學院生物研究所生產的SBA-40D型生物傳感分析儀測定葡萄糖含量；聚戊糖含量的測定見文獻[21]；預處理前后稻草纖維素與聚戊糖含量的測定見文獻[22]。

1.2.4相關計算

某成分的保留率是指預處理后原料中某成分(如纖維素、木素、半纖維素等)的保留量對預處理前原料中該成分含量的百分比；酶水解轉化率指預處理后原料經過酶水解后得到的葡萄糖對預處理后原料中葡聚糖的百分比；葡萄糖得率是指預處理后原料經酶水解后得到的葡萄糖與原料中葡聚糖的百分比。計算公式如下：

式中，W、W1、W2、W3分別表示預處理原料得率、成分保留率、酶水解轉化率、葡萄糖得率；X、X1分別表示預處理前后原料成分含量；C表示酶水解液葡萄糖濃度；m、m1分別表示預處理前后原料葡萄糖含量；0.1表示水解液體積為0.1 L；0.9表示葡萄糖和葡聚糖的換算系數；2表示所取預處理原料絕干質量為2 g。

2 結果與討論

實驗所用稻草的主要化學成分如表1所示。與玉米秸稈、麥草等農業廢棄物相比，稻草的纖維素和木素含量低,而灰分高。不同的化學成分含量會對預處理效果產生影響。本實驗在預處理溫度、時間和固液比一定的條件下重點研究了亞硫酸氫鹽用量對稻草主要化學成分的去除和酶水解效率的影響。

表1 稻草主要化學成分 %

注 纖維素含量通過葡聚糖含量反映。

2.1對預處理過程中亞硫酸氫鹽用量的探討

2.1.1亞硫酸氫鹽用量對稻草預處理得率的影響

在固液比1∶4、溫度170℃、保溫時間30 min、硫酸用量1.84%條件下對稻草進行預處理,研究亞硫酸氫鈉用量對稻草預處理得率的影響,結果如圖1所示。從圖1可以看出,隨亞硫酸氫鈉用量的增加,稻草預處理得率呈先下降后上升趨勢；在亞硫酸氫鈉用量為1.5%～4.5% 范圍內,稻草預處理得率由39.6%降到37.3%；當亞硫酸氫鈉用量繼續增加至12.0%時,稻草預處理得率為42.5%,比最低點增加了5.2個百分點。由于稻草主要由纖維素、半纖維素、木素等成分構成,它們在預處理過程中的溶出將直接影響預處理得率的變化規律。下面將結合稻草預處理后化學成分的變化對這種現象加以解釋。

圖1 亞硫酸氫鈉用量對稻草預處理得率的影響

圖2 亞硫酸氫鈉用量對預處理稻草化學成分的影響

2.1.2亞硫酸氫鹽用量對預處理稻草化學成分的影響

亞硫酸氫鈉用量對預處理稻草化學成分的影響如圖2所示。由圖2(a)可以看出,隨亞硫酸氫鈉用量的增加,預處理稻草纖維素含量逐漸增加；當亞硫酸氫鈉用量大于7.5%時，預處理稻草纖維素含量保持穩定。當亞硫酸氫鈉用量小于4.5%時,纖維素保留率基本沒有變化；但當亞硫酸氫鈉用量由4.5%增至7.5%時,纖維素保留率快速上升；繼續增加亞硫酸氫鈉用量,纖維素保留率基本穩定。在亞硫酸氫鈉用量7.5%條件下,預處理稻草纖維素含量和纖維素保留率均達到一個較高值,此時,纖維素保留率達到80%以上。繼續增加亞硫酸氫鈉用量至12.0%,預處理稻草纖維素含量和纖維素保留率變化緩慢。這表明存在一個合適的亞硫酸氫鈉用量,該用量有助于纖維素在酸性條件下的保留,避免纖維素發生酸催化水解。SHI Yan[23]研究認為,亞硫酸氫鈉在酸性條件下會與六碳糖醛基形成加合物,從而阻止六碳糖進一步降解。至于亞硫酸氫鈉在酸性條件下如何阻止纖維素進一步發生水解反應,有待進一步研究。

由圖2(b)可以看出,當亞硫酸氫鈉用量小于3.0%時,預處理稻草聚戊糖的含量和保留率降低幅度較大,此后,隨亞硫酸氫鈉用量的增加,聚戊糖的含量和保留率基本保持穩定,聚戊糖的保留率約為17%。這可能是因為本實驗是在高溫酸性條件下進行的,絕大部分容易水解的半纖維素已被溶出,亞硫酸氫鈉對殘存的較難水解的半纖維素去除作用不明顯。

由圖2(c)可以看出,隨亞硫酸氫鈉用量的增加,預處理稻草木素的含量和保留率均逐漸下降。當亞硫酸氫鈉用量為12.0%時,幾乎一半的木素被脫除。這說明亞硫酸氫鈉有助于木素脫除,主要原因是木素和亞硫酸氫根離子發生磺化反應并生成親水性的木素磺酸鹽而溶出[24]。亞硫酸氫鈉用量的增加使體系中亞硫酸氫根離子增多,為木素磺化反應提供了有利條件,促進了木素溶出。因此,預處理稻草木素的含量和保留率隨亞硫酸氫鈉用量的增加而呈明顯下降的趨勢。

從圖2(d)可以看出,隨亞硫酸氫鈉用量的增加,預處理稻草灰分及灰分保留率均呈先下降后上升最終趨于穩定的趨勢。當亞硫酸氫鈉用量為3.0%時,預處理稻草灰分及灰分保留率最低。繼續增加亞硫酸氫鈉用量,預處理稻草灰分及灰分保留率增大；但當亞硫酸氫鈉用量大于7.5%時,預處理稻草灰分保留率保持穩定,此時約57%的灰分溶出。

考察了稻草預處理過程中各成分的變化規律后,就可以較好地解釋預處理得率所呈現的變化規律。在亞硫酸氫鈉用量為1.5%～4.5%范圍內,聚戊糖、木素和灰分的溶出增多,而纖維素基本沒有變化,使得預處理得率呈下降趨勢。在亞硫酸氫鈉用量為4.5%～7.5%范圍內,半纖維素溶出基本保持不變,纖維素和灰分保留率增大,木素的溶出率有較大幅度上升。由于木素在原料中含量較少(僅為14.69%),纖維素是原料的最主要成分(含量31.73%),所以木素的溶出對預處理得率的變化不起主要作用,對預處理得率變化起主要作用的是纖維素,導致預處理得率隨纖維素保留率的增大而增大。當亞硫酸氫鈉用量大于7.5%時,聚戊糖溶出基本不變,纖維素和灰分保留率呈緩慢上升的趨勢,雖然木素繼續溶出,但其對得率影響不大,因此，最終的結果是預處理得率呈緩慢上升的趨勢。

2.1.3亞硫酸氫鹽用量對稻草酶水解效果的影響

亞硫酸氫鈉用量對稻草酶水解效果的影響如圖3所示。從圖3可知,隨亞硫酸氫鈉用量的增加,酶水解轉化率和葡萄糖得率逐漸上升。當亞硫酸氫鈉用量為10.5%時,酶水解轉化率與葡萄糖得率均達到最大值。繼續增加亞硫酸氫鈉用量,酶水解轉化率與葡萄糖得率略有下降。增加亞硫酸氫鈉用量能夠促進木素脫除和半纖維素水解,從而使得纖維素酶能夠與纖維素更好地接觸,促進預處理稻草酶水解。由于亞硫酸氫鈉用量的增加有助于預處理稻草纖維素保留率的提高,使得當亞硫酸氫鈉用量大于7.5%時,葡萄糖得率大幅提高。本實驗酶水解轉化率和葡萄糖得率均不夠高,這主要與所采用的纖維素酶的用量和來源有關。

圖3 亞硫酸氫鈉用量對預處理稻草酶水解轉化率和葡萄糖得率的影響

2.2預處理稻草各主要成分保留率與酶水解轉化率的相關性

預處理過程中木素、聚戊糖及纖維素保留率與預處理稻草酶水解轉化率的相關性如圖4～圖6所示。預處理稻草酶水解轉化率隨木素保留率的減小而增大,兩者呈較好的負相關線性關系,相關系數為0.9176(見圖4)；聚戊糖保留率與預處理稻草酶解轉化率大體呈負相關關系,兩者之間相關性低,相關系數只有0.4633(見圖5)。這主要是因為亞硫酸氫鹽能夠促進木素的大量溶出,隨木素溶出量的增加,預處理稻草的結構變得疏松多孔,加大了纖維素酶對纖維素的可及性,從而提高預處理稻草的酶水解轉化率。半纖維素溶出一般分為2個階段：一是快速溶出段,二是慢速溶出段。在本實驗特定條件(pH值<3.2)下,半纖維素溶出率達到了79%～84%,殘余半纖維素的溶出處于慢速溶出段,雖然該過程能夠使預處理稻草結構更加疏松多孔,但對纖維素酶與纖維素的接觸沒有特別明顯的促進作用。纖維素保留率與預處理稻草酶水解轉化率呈正相關關系,兩者的相關系數(見圖6)低于木素的,但高于半纖維素的,這說明在預處理過程中減少纖維素的降解對酶水解轉化率有益。由此可知,酸性亞硫酸氫鹽預處理稻草提高酶水解轉化率的主要原因是通過亞硫酸氫鹽對木素的磺化作用,導致更多木素溶出,使預處理稻草結構更加疏松多孔,增大纖維素酶與纖維素的可及性,從而提高葡萄糖得率。而稀酸法預處理是通過溶解生物質成分中的半纖維素來增大纖維素酶的可及性,從而提高酶水解轉化率[25]。這是2種預處理方法的不同之處。

圖4 預處理稻草木素保留率與酶水解轉化率的相關性

圖5 預處理稻草聚戊糖保留率與酶水解轉化率的相關性

圖6 預處理稻草纖維素保留率與酶水解轉化率的相關性

3 結 論

3.1在SPORL法預處理稻草過程中,亞硫酸氫鹽能促進稻草木素的脫除和半纖維素的水解溶出,但卻有利于預處理稻草纖維素的保留；其對稻草灰分也有一定影響。

3.2在SPORL法預處理稻草過程中,增加亞硫酸氫鹽用量,預處理稻草酶水解轉化率和葡萄糖得率提高。預處理稻草的木素、半纖維素和纖維素的含量對酶水解轉化率均有影響：木素保留率與預處理稻草酶水解轉化率呈較好的負相關線性關系；半纖維素溶出對預處理稻草酶水解轉化率也有促進作用,但相關性較差。預處理稻草主要成分的保留率與酶水解轉化率的相關性從大到小順序為：木素>纖維素>半纖維素。

3.3SPORL法預處理是一種不同于稀酸法的預處理方法,兩者的不同之處在于亞硫酸氫鹽對木素的磺化作用,導致更多的木素溶出,使預處理稻草更加疏松多孔,增大纖維素酶對纖維素的可及性,從而提高葡萄糖得率。

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