黃連醇提物對真菌幾丁質合酶的抑制作用

，， ， ，倩雯，

(浙江工業大學 生物與環境工程學院，浙江 杭州 310032)

近年來，真菌感染、特別是條件致死性真菌感染發病率在長期應用廣譜抗生素、激素、免疫抑制劑和化療后的病人中逐年增高,已成為近代醫學對腫瘤、白血病、糖尿病、放射病和燒傷病人治療中的疑難問題,越來越受到醫學界的重視[1].另一方面，目前臨床上使用的抗真菌藥物種類有限，而且多數有副作用和抗藥性問題，迫切需要開發新型高效廣譜并具有選擇性毒力的抗真菌藥物[2].由于真菌細胞壁幾丁質成分是真菌特有的，動植物均不含有幾丁質，因此幾丁質合成酶是抗真菌劑的理想靶標之一[3-4].黃連是中國的傳統中草藥，應用廣泛，常用于治療濕熱內蒸、百日咳、痞滿脹悶、泄瀉痢疾、消渴、膽囊炎、癰疽腫毒、中耳炎、急性扁桃體炎、大葉性肺炎、煩躁嘔逆、流行性腦脊髓膜炎等,且具有抗放射及促進細胞代謝的作用[5-6].本研究采用酵母細胞作為篩選模型對98種常用中草藥的抗真菌活性進行了檢測，發現黃連醇提液能挽救酵母在CFW(Calcofluor white)抑制濃度下的生長，黃連醇提液處理后的酵母細胞幾丁質含量明顯降低，表明黃連醇提液具有抑制酵母幾丁質合成酶的活性.

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 實驗菌株

釀酒酵母(S.cerevisiae)WHU2a由日本廣島大學宮川都吉教授惠贈；釀酒酵母CHT003和釀酒酵母CHT020由本實驗室構建并保藏.

1.1.2 實驗材料

黃連(CoptischinensisFranch)購自杭州華東大藥房；兩性霉素B購自上海生工；尼克霉素Z，5-氟胞嘧，灰黃霉素，Calcofluor white均購自Sigma.

1.2 方 法

1.2.1 黃連醇提物的制備

黃連粉碎后，稱取80 g，加95%乙醇320 mL，浸泡48 h后用0.22 μm濾膜過濾，黃連醇提取液的濃度為250 mg/mL.

1.2.2 黃連醇提物對酵母在CFW抑制濃度下的生長挽救實驗

制備含6 μg/mL CFW的YPD平板備用.挑取活化2 d的酵母WHU2a，接入5 mL YPD液體培養基中，30 ℃，180 r/ min，培養16 h.稀釋菌懸液并與4 mL含CFW的上層YPD培養基混勻后倒入含6 μg/mL CFW的YPD平板制成雙層平板，使上層含有5×104個/mL酵母細胞和6 μg/mL CFW.將黃連乙醇提取物40 μL滴加在干燥無菌的Whatman 3MM濾紙片(直徑6 mm)上，待其乙醇揮發干燥后用無菌鑷子夾取帶藥的濾紙片水平放入皿內上層培養基上，以乙醇40 μL滴加在濾紙片上待其揮發干燥后作為空白對照.另取尼可霉素6 μL(含量為30 μg)，滴加在干燥無菌的濾紙片上作為正對照；取兩性霉素B 6 μL(含量為6 μg)，滴加在干燥無菌的濾紙片上作為負對照.28 ℃培養48 h后，觀察藥物對酵母生長的挽救現象.

1.2.3 幾丁質合成酶缺陷型酵母對黃連醇提物的敏感性實驗

1) 黃連醇提物對酵母的抑菌作用的測定

分別挑取活化2 d的酵母WHU2a，CHT020，CHT003，接入5 mL YPD液體培養基的試管中，30 ℃，180 r/min，16 h.稀釋菌懸液并與4 mL上層YPD培養基混勻后倒入YPD平板制成雙層平板，使上層含有5×104個/mL酵母細胞.取黃連乙醇提取物40 μL，滴加在干燥無菌的濾紙片(直徑6 mm)上，待其乙醇揮發干燥后用無菌鑷子夾取帶藥的濾紙片水平放入皿內雙層培養基上，以乙醇40 μL滴加濾紙片上待其揮發干燥后作為空白對照.以兩性霉素B5 μL(含量為5 μg)；5-氟胞嘧啶10 μL(含量為40 μg)；灰黃霉素10 μL(含量為100 μg)作為對照.28 ℃，培養48 h后用十字交叉法測量抑菌圈的直徑并觀察差異，即：抑菌圈直徑(mm)=抑菌透明圈直徑-6.

2) 黃連醇提物對酵母的最低抑制質量濃度(MIC)的測定

MIC值的測定參照汪倩雯等的微量稀釋法[7]，并作某些修改.分別挑取活化2 d的酵母WHU2a，CHT020，CHT003單菌落至無菌水中，制成3×103CFU/mL的菌懸液，備用.在96孔板每列8孔中每孔加入100 μL用95%乙醇倍量稀釋的黃連醇提液，其質量濃度從高到低依次為250.00，125.00，62.50，31.25，15.63，7.80，3.90，1.95 mg/mL，待其乙醇揮發干燥后，加100 μL的無菌水將黃連溶解.然后，再加100 μL的YPD培養基和100 μL的菌懸液(終質量濃度為1×103CFU/mL).以100 μL的無菌水替代黃連溶液為陰性對照，以兩性霉素B替代黃連溶液為陽性對照(終質量濃度依次為4，2，1，0.5，0.25 μg/mL).30 ℃，48 h培養后觀察菌體的生長情況，未見菌生長的最低藥物濃度即為藥物對酵母的最低抑菌濃度(MIC).每個菌株做三個平行實驗.

1.2.4 黃連醇提物對酵母細胞幾丁質合成的影響

分別取對數生長期的WHU2a，CHT020和CHT003酵母細胞加入到100 mL含有黃連醇提物的YPD培養基，使初始細胞濃度為2×106個/mL，28 ℃，200 r/min，培養20 h.其中，加入的黃連醇提物濃度隨菌株而異，對應于WHU2a，CHT020和CHT003分別為1.56 mL，1 mL，0.9 mL，以乙醇代替黃連醇提物作為對照.將培養20 h的酵母細胞3 000 r/min離心5 min，棄上清，加蒸餾水50 mL震蕩20 s，待酵母細胞重新懸浮后再次離心.重復該步驟兩次以除去培養基雜質.收集酵母細胞，60 ℃烘箱中置放4 h，待其水分充分除去后，加入液氮，充分研磨以使細胞破碎.酵母細胞壁幾丁質含量的測定方法參考本研究室已發表的論文[8].

2 結果分析與討論

2.1 黃連醇提物能緩解CFW對酵母的抑制作用

熒光增白劑(CFW)能與酵母細胞壁中新合成的幾丁質結合并抑制其生長，Roncero等研究發現尼克霉素(Nikkomycin Z，NiZ)等幾丁質合成酶抑制劑均能使酵母在CFW抑制濃度下的生長得到挽救[9].本實驗中，尼克霉素的周圍有明顯的酵母生長圈，表明尼克霉素具有明顯的挽救作用能夠解除CFW對酵母的抑制(圖1中C)，而空白對照以及負對照兩性霉素B均沒有挽救作用，有趣的是黃連醇提物對酵母生長也有挽救現象(圖1中B)，由此可以推斷黃連醇提物中存在幾丁質合成酶抑制劑活性成分.

A—空白對照；B—黃連；C—尼克霉素；D—兩性霉素B

2.2 幾丁質合成酶缺陷型酵母對黃連醇提物的敏感性

為了進一步驗證黃連醇提物具有抑制真菌幾丁質合成酶的活性，實驗測定和比較了黃連醇提物對于野生型酵母WHU2a，以及2種不同幾丁質合成酶缺陷型酵母CHT020和CHT003菌株的抑菌作用，結果見表1.

表1 黃連醇提物對三種酵母的抑菌圈

上述實驗中，CHT003菌株是Chs1，Chs2基因敲除的酵母菌株，該酵母僅剩下一個Chs3基因，該菌株對幾丁質合成酶Ⅲ(CS3)的特異性抑制劑敏感性增加；而CHT020菌株是Chs1，Chs3基因敲除的酵母菌株，該酵母僅剩下一個Chs2基因，該菌株對幾丁質合成酶Ⅱ(CS2)的特異性抑制劑敏感性增加[10-11].與野生型菌株WHU2a比較,黃連醇提物對于CHT003有明顯的抑制作用，CHT003的抑菌圈比WHU2a的抑菌圈大二倍以上；而CHT020的抑菌圈僅比WHU2a的抑菌圈略微大一些.實驗同時比較了兩性霉素B、5-氟胞嘧啶、灰黃霉素等具有不同作用機制的常用抗真菌劑對上述三種酵母的抑制作用，結果均無明顯的特異性抑制作用，表明這些抗真菌劑的作用靶標不是幾丁質合成酶.在本實驗的濃度范圍內，灰黃霉素對三種酵母均無抑菌作用.實驗還進一步測定了黃連醇提物對于WHU2a，CHT020，CHT003的MIC值，實驗結果見表2.

表2 黃連醇提物對三種酵母的MIC值

從表2中可以看出:幾丁質合成酶缺陷型酵母(CHT003和CHT020)對黃連醇提物更加敏感，尤其CHT003的敏感性是野生酵母的4倍.表2實驗結果不僅與正篩選結果(圖1)一致，而且進一步揭示了黃連醇提物中明顯存在幾丁質合成酶Ⅲ(CS3)的特異性抑制活性成分.由于在酵母細胞中90%的幾丁質是由幾丁質合成酶Ⅲ(CS3)合成的，可以預期黃連醇提物處理后酵母細胞幾丁質含量會明顯下降.

2.3 黃連醇提物處理后酵母細胞幾丁質含量的變化

由于幾丁質是由β-(1,4)-2-乙酰氨基-2-脫氧-D-葡萄糖殘基呈線形連接而成的生物大分子聚合物，因此，可通過測酵母細胞中N-乙酰-D-葡糖胺的量來確定細胞中的幾丁質含量[8].實驗得出標準曲線公式為x=(y-0.011 5)/0.004 5，酵母細胞中幾丁質含量是三次實驗結果的平均值如圖2所示.

圖2 酵母細胞中的幾丁質含量

對未加黃連的實驗結果進行比較后發現，菌株CHT003的幾丁質含量達到17 μg/mg，比野生型WHU2a還高20%.Garcia-Rodriguez等發現敲除釀酒酵母中葡聚糖合成酶基因fks1后會引起CS3活性大幅提高[16].Lesage等也報道了釀酒酵母細胞壁幾丁質合成中的互補現象，多數參與細胞壁合成的基因被敲除后都會引起CS3活性和幾丁質含量的明顯提高[17].CS3負責酵母中90%以上幾丁質的合成.由此可以解釋CHT003的幾丁質含量比野生型更高是因為Chs1和Chs2基因敲除促進了Chs3基因表達的結果.加黃連后的實驗結果與我們的預期相符，黃連醇提物處理后的釀酒酵母WHU2a細胞壁中幾丁質含量降低了28%，CHT003細胞壁中幾丁質含量降低22.6%，而黃連醇提物處理后的釀酒酵母CHT020幾丁質含量降低較少.這些結果進一步證實了中藥黃連醇提取物中含有抑制酵母細胞壁幾丁質合成酶Ⅲ的活性物質.

2.4 討 論

黃連是一種傳統的中藥，具有很高的藥用價值.對其藥理作用也有不少研究.Kobayashi等從黃連根莖中分離出2個原小檗堿生物堿(表小檗堿和groenlandicine)，研究發現分別是拓撲異構酶Ⅰ和Ⅱ的抑制劑，對細胞DNA的復制、轉錄和重組等起重要作用[12].Hirano等從黃連中分離到落葉松脂素和反式阿魏酸對羥基苯乙酯，研究表明：二者為自由基清除劑，均顯示SOD樣作用，落葉松脂素作為超氧化物自由基清除劑比抗壞血酸更為有效[13].Kong等發現黃連中的小檗堿有降低膽固醇作用[6].黃連也具有抗真菌作用，但是其作用機理還不清楚[14].

Park等曾報道過黃連中的巴馬亭在體外會抑制假絲酵母的幾丁質合成酶活性，但沒有提到是哪一種幾丁質合成酶[15].本研究用釀酒酵母作為模型，通過檢測98種常用中草藥的醇提物對酵母在CFW抑制濃度下的生長挽救現象，發現黃連醇提物對酵母幾丁質合成酶有抑制作用.釀酒酵母有3個幾丁質合成酶結構基因Chs1，Chs2和Chs3，其中Chs2和Chs3具有重要的生物學功能[10].Chs2與有絲分裂末期的母細胞和子細胞之間合成初級隔膜有關；Chs3與細胞出芽位點處合成幾丁質環有關，并與正常細胞中90%的幾丁質合成有關.Chs1及Chs2基因敲除后的幾丁質合成酶缺陷型酵母CHT003，以及Chs1及Chs3基因敲除后的幾丁質合成酶缺陷型酵母CHT020都能正常生長；但CHT003對幾丁質合成酶Ⅲ的抑制劑高度敏感而CHT020對幾丁質合成酶Ⅱ的抑制劑高度敏感[11].本實驗觀測到黃連醇提物對野生型酵母，CHT020以及CHT003的MIC值分別為2 600，1 300，650 mg/L，表明黃連醇提物中主要含有抑制幾丁質合成酶Ⅲ的活性成分；幾丁質含量測定實驗揭示，黃連醇提物處理后野生型酵母和CHT003幾丁質含量均大幅降低，而CHT020幾丁質含量降低較少，進一步驗證了上述結果.黃連醇提物中具有抑制真菌幾丁質合成酶Ⅲ的活性成分，可以作為特異性抑制真菌藥物值得進一步研究.

3 結 論

本實驗以酵母細胞為模型，研究了黃連醇提液對真菌細胞壁幾丁質合酶的抑制作用，通過檢測黃連醇提液對酵母在熒光增白劑(Calcofluor white，CFW)抑制濃度下的生長挽救現象，比較黃連醇提液對野生型和幾丁質合酶缺陷型酵母菌株抑制作用的差異，以及測定黃連醇提物處理后酵母細胞壁幾丁質含量的變化，結果顯示黃連醇提液能挽救酵母在CFW抑制濃度下的生長，幾丁質合酶缺陷型菌株CHT003對黃連醇提液的敏感性比野生型大4倍，黃連醇提液處理后野生型酵母和缺陷型菌株CHT003的幾丁質含量明顯降低.說明黃連醇提物具有明顯的抑制酵母細胞壁幾丁質合酶Ⅲ的活性成分.

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