染料木素對AD大鼠海馬CaM-CREB信號轉導通路相關蛋白的影響

鮑 鑫 ，蔡 標 ，2，王 艷 ，2，梁 杰 ，李珊珊

（1.安徽中醫藥大學，安徽合肥230038； 2.安徽省中醫藥科學院，安徽合肥230038）

目前，中國已進入老齡化社會，阿爾茨海默?。ˋlzheimer′s disease，AD）的高發病率已引起醫學界的高度關注，它是一種進行性神經退行性疾病。染料木素（Genistein，GS）是大豆異黃酮最主要活性成分，與人類雌激素結構相似，與雌激素受體（ER）特別是雌激素受體β（ERβ）有較高的親和力，具有弱雌激素樣作用［1-3］。因此，GS成為雌激素的天然替代品。相關研究表明，GS能使海馬和皮質神經凋亡的數量減少，對體外培養的皮層和海馬神經元起到保護作用［4］，在防治AD中能通過對抗β淀粉樣蛋白的毒性保護神經［5］。本實驗通過觀察染料木素對AD大鼠學習記憶能力的影響和海馬組織形態學變化，檢測AD大鼠海馬組織鈣調蛋白（calmodulin，CaM）含量、海馬組織環腺苷酸反應元件結合蛋白（cAMP response element-binding protein，CREB）、磷酸化 CREB（p-CREB）的表達，研究染料木素對阿爾茨海默病大鼠海馬CaM-CREB信號轉導通路的影響，探討染料木素預防AD、改善學習記憶功能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 選用安徽醫科大學實驗動物中心提供的體重250 g～350 g的10月齡SD雌性大鼠120只［清潔級，合格證SXCK（皖）2011-002］。自由攝食與飲水。

1.1.2 藥物與試劑 染料木素（純度90%，Sigma公司提供，批號110223）；羧甲基纖維素鈉（國藥集團化學試劑有限公司提供，批號 F20101221）；Aβ25～35（Sigma公司提供，批號108K4794）；戊酸雌二醇片（Estradiol Valerate，EV）（DELPHARM Lille S.A.S 公司提供，批號142A）；CaM測定試劑盒（上?；顦飞锟萍加邢薰?，批號 20110569）；CREB（一抗，美國Stancruz公司提供，批號BS1624）；p-CREBS133（一抗，美國Stancruz公司提供，批號BS4053）；二抗試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號812251A）。

1.1.3 實驗儀器 雙臂數字式腦立體定位儀（美國stoelting產品）；RWD-202微量注射泵（深圳瑞沃德生命科技有限公司產品）；722N型分光光度計（上海精密科學儀器有限公司產品）；Multiskan MK2型酶標儀（Labsystem產品）；Wellwash 4 MK2型洗板機（Labsystem產品）；移液器（Eppendorf產品）；BX51型光學顯微鏡（日本OLYMPUS產品）；JEDA 801D圖像采集處理系統（江蘇捷達產品）。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組與給藥 將120大鼠隨機分為空白組（Blank）、模型組（OVX）、染料木素高劑量組（GS-H，90 mg/kg）、染料木素中劑量組（GS-M，30 mg/kg）、染料木素低劑量組（GS-L，10 mg/kg）、雌激素陽性對照組（戊酸雌二醇組，EV，0.4 mg/kg）6組，每組20只。預先給藥7 d后，以D-半乳糖聯合Aβ25～35誘導制備AD大鼠模型［6］，連續28 d。用0.5%羧甲基纖維素鈉將染料木素分別配成濃度為9 mg/mL（GS-H組）、3 mg/mL（GS-M組）、1 mg/mL（GS-L組）的混懸液，蒸餾水加戊酸雌二醇配制成濃度為0.04 mg/mL的溶液。每組每天灌胃給予相應的藥物（1 mL/100 g），模型組給予等量的0.5%羧甲基纖維素鈉?？瞻捉M正常喂養。

1.2.2 造模 大鼠經腹腔注射10%水合氯醛380 mg/kg麻醉后，固定于腦立體定位儀上。無菌條件下操作，沿頭頂部正中線1 cm縱向切口，暴露前囟，參照大鼠腦立體定位圖譜，以前囟為原點，旁2.2 cm，后4.4 cm為穿刺點，鉆孔穿顱。進針深度3.0 mm至雙側海馬，一次性注射 Aβ25~351 μL（10 μg），5 min內緩慢注入，并留針5 min。傷口撒少許青霉素鈉粉末后進行縫合，碘酒常規消毒，術后連續3 d腹腔注射青霉素鈉預防感染［6］?？瞻捉M不做處理。

1.2.3 取材 治療結束后，各組取10只大鼠，經腹腔注射10%水合氯醛380 mg/kg麻醉后，快速在生理鹽水冰面上取腦，分離海馬組織，稱取組織重量加9倍生理鹽水，冰浴中3000 r/min離心10 min，勻漿10次，制備成10%腦勻漿。-80℃冰箱中保存，待測CaM含量。每組取10只經心臟行灌注固定：經腹腔注射10%水合氯醛380 mg/kg麻醉后，剪開胸廓找到心臟，于心尖處插入灌注針頭，快速滴入冷生理鹽水200 mL，接著注入350 mL 4%多聚甲醛，取出腦組織后置于4%多聚甲醛中放入4℃冰箱固定。待觀察大鼠海馬組織形態結構變化及CREB、p-CREB表達。

1.2.4 檢測指標 造模后15 d對各組大鼠進行Morris水迷宮訓練觀察GS對AD大鼠學習記憶的影響。訓練1次/d，共6 d。訓練時選擇1個入水點，將大鼠面向池壁放入水中，觀察并記錄大鼠尋找并爬上平臺所需時間（逃避潛伏期）。如果大鼠在120 s內未找到平臺，需將其引至平臺，這時潛伏期為120 s。訓練期間水溫保持在（26±1）℃，迷宮外參照物保持不變。將各組第6天的成績進行比較，數據采集和處理由Morris水迷宮圖像自動監視處理系統完成。

將固定的大鼠腦組織進行常規病理切片和HE染色后，觀察海馬組織形態并進行圖像采集。采用ELISA法按試劑盒說明檢測AD大鼠CaM含量。采用免疫組化SP法檢測海馬組織CREB、p-CREB。嚴格按照試劑盒操作方法，DAB顯色，蘇木精復染，最后脫片、透明及封片。

在顯微鏡下觀察每張切片海馬 CA1、CA2、CA3、CA4區域并隨機各取1個視野拍照。神經元胞核內染棕黃色為CREB或p-CREB陽性表達，采用JEDA 801D形態學圖像分析系統拍照并統計陽性表達的平均光密度（mean optical density，MOD）。

1.3 統計學方法

用SPSS13.0軟件進行統計學處理。所有試驗數據采用均數±標準差（±s）表示。組間用單因素方差分析，多組之間兩兩比較采用LSD法，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 對AD大鼠Morris水迷宮成績的影響

Morris 水迷宮實驗顯示，Blank、OVX、GS-H、GS-M、GS-L、EV組大鼠逃避潛伏期分別為（15.79±6.42）s，（24.55±7.10）s，（13.58±7.30）s，（16.39±5.07）s，（17.67±6.87）s，（17.51±7.83）s。與空白組對比，模型組逃避潛伏期明顯延長（P＜0.01）；與模型組比較，染料木素高、中、低劑量組和戊酸雌二醇組逃避潛伏期明顯縮短（P＜0.01）；與戊酸雌二醇組相比，染料木素高劑量組逃避潛伏期顯著縮短（P<0.05），染料木素中、低劑量組逃避潛伏期差異無統計學意義。

2.2 對AD大鼠海馬組織形態學變化的影響

在光鏡下觀察，Blank組大鼠的海馬細胞染色均勻，胞核完整、形態完好呈錐形、排列規則。GS-H組神經細胞排列緊密，染色均勻。模型組海馬神經細胞排列紊亂，數量減少且層數也減少，錐體細胞顆?？张葑冃?，并出現許多有空暈的固縮細胞。GS-M組腦組織神經細胞少數出現上述變化。GS-L組胞核固縮的神經細胞多見，EV組神經細胞破裂者較多。結果見圖1。

圖1 各組大鼠海馬組織CA3區形態結構變化（HE×400）

2.3 對AD大鼠海馬CaM含量、CREB及p-CREB表達的影響

由表1可見，與Blank組比較，OVX組海馬組織CaM含量、CREB及p-CREB的MOD顯著升高（P<0.01）；與OVX組比較，染色木素各劑量組、EV組海馬組織CaM含量及CREB及p-CREB的MOD均顯著降低（P<0.05，P<0.01）；與 EV 組比較，GS-L組p-CREB的MOD顯著升高（P<0.05）。Blank組大鼠海馬組織 CREB、p-CREB呈輕度表達；OVX組CREB、p-CREB呈強陽性表達；GS-H組、GS-M組和 EV組 CREB、p-CREB呈中度表達；GS-L組CREB、p-CREB呈高度表達。結果見表1、圖2、圖3。

表1 染料木素對AD大鼠海馬CaM含量、CREB及p-CREB表達的影響 （±s）

表1 染料木素對AD大鼠海馬CaM含量、CREB及p-CREB表達的影響 （±s）

注：與 Blank 組比較，1）P<0.01；與 OVX 組比較，2）P<0.05，3）P<0.01；與 EV 組比較，4）P<0.05

組別n劑量（mg/kg）CaM/（ng/L）CREB（MOD）p-CREB（MOD）Blank 組 10 - 80.51±9.980.252±0.0120.219±0.021 OVX 組 10 - 93.75±9.851） 0.350±0.0211） 0.325±0.0181）GS-H 組 109073.79±6.153） 0.272±0.0192） 0.267±0.0162）GS-M 組 103078.96±12.973） 0.284±0.0142） 0.281±0.0202）GS-L 組 101082.50±7.282） 0.291±0.0202） 0.289±0.0172）4）EV 組 100.474.78±9.243） 0.282±0.0162） 0.269±0.0112）

圖2 各組大鼠海馬組織CA3區CREB的表達（SP×400）

3 討 論

圖3 各組大鼠海馬組織CA3區p-CREB的表達（SP×400）

海馬是學習記憶的重要部位，而AD病的最顯著特征之一就是學習記憶能力障礙。AD的主要病理變化為腦內神經細胞顆?？张輼幼冃砸约吧窠浽w維纏結（Neurofibrillary tangles，NFT）［7］。實驗證明，雌激素水平增高時，可以對受損的神經元發揮保護效應，抑制凋亡，減少AD的發生［8］。而GS具有類雌激素樣的作用，是防治AD的理想藥物。腦內注射Aβ25-35可以出現類似AD的病理變化，因此本實驗采用了Aβ25-35造模。海馬組織病理切片觀察顯示，Blank組海馬組織神經細胞排列整齊。OVX組海馬CA1區神經元排列紊亂，層數減少，神經元數目較假手術組明顯減少。錐體細胞顆?？张輼幼冃?，部分細胞凋亡，出現體積縮小，細胞核破裂至細胞呈紅色。GS-H組海馬CA1區的錐體細胞顆?？张輼幼冃詼p少，神經細胞丟失明顯減少。低、中劑量組也有類似變化。

AD的發病與神經元鈣穩態失調有關，這種失調發生于神經元、星型膠質、少突膠質和小膠質細胞中，直接導致神經元結構和功能的失常及細胞的壞死［9］。CaM是細胞中一種重要的多功能蛋白，它可以激活40多種酶或者通道，參與許多生物功能。CaM不僅參與了神經元和星形膠質細胞的信號級聯放大系統，參與突觸可塑性、細胞分化和增生，還在長時程增強效應和學習記憶中起重要作用［10-11］。AD發病時神經元內Ca2+超載，Ca2+激活鈣調蛋白（CaM），成為有活性的鈣-鈣調蛋白復合物（Ca2+/CaM）。Ca2+/CaM激活鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ（calmodulindependent protein kinase Ⅱ，CaMKII），CaMKII可使CREB磷酸化，磷酸化CREB激活下游調控基因的表達，最終導致神經元損傷/抗損傷平衡的失調而引起細胞死亡，引起記憶功能障礙，最終形成AD。本實驗結果表明：在Aβ海馬注射造AD大鼠模型后，大鼠海馬CaM、CREB和p-CREB蛋白表達增加，染料木素可明顯改善AD大鼠學習記憶能力；染料木素可明顯減少AD大鼠海馬組織神經元的丟失，具有神經保護作用；染料木素可顯著性降低AD大鼠海馬組織CaM的含量，降低海馬組織CREB和p-CREB的表達。

本實驗結果表明，染料木素可能通過減少Aβ在大鼠海馬的沉積，減少神經元鈣超載以穩定神經元鈣穩態平衡，從而減少CaM、CREB和磷酸化CREB的含量，減少海馬神經元丟失，改善學習記憶的能力，起到預防AD的作用。

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