新安固本培元方對脾虛型潰瘍性結腸炎大鼠細胞因子的影響

賀云周，董昌武，張曉軍，李必澤

（安徽中醫藥大學，安徽合肥230038）

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）又稱非特異性潰瘍性結腸炎，系原因不明的大腸黏膜的慢性炎癥和潰瘍性病變，臨床以腹痛、腹瀉、膿血便等為主要表現，病程長，復發率高，治療比較棘手。隨著生活方式及飲食結構的改變，在我國UC發病率有逐年上升的趨勢，西醫目前仍以氨基水楊酸（如柳氮磺胺吡啶等）和激素為主，并未獲得突破性進展，且長期服用西藥毒副作用比較大。近年研究認為，細胞因子在發病、發展及預后中的作用已得到公認，促炎性細胞因子和抗炎性細胞因子之間的平衡失調起著關鍵性作用［1］。本實驗模擬脾虛證的臨床致病因素，探討新安固本培元方對脾虛型UC大鼠細胞因子的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 選用清潔級Wistar大鼠60只，雌雄各半，體重200 g~300 g，由安徽醫科大學動物實驗中心提供。

1.1.2 藥品與試劑 新安固本培元方（人參6 g，黃芪 20 g，白術 15 g，茯苓 12 g，當歸 10 g，白芍 12 g，麥冬 12 g，陳皮 12 g，黃柏 10 g，黃芩 12 g，甘草 6 g），購自安徽中醫藥大學第一附屬醫院門診部，濃煎至1 g/mL，4℃冰箱保存備用，柳氮磺吡啶（SASP，上海福達制藥有限公司，批號0411109），冰乙酸（山東博山化學試劑廠生產，批號 67678），IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α檢測試劑盒（北京福瑞生物有限公司）。

1.1.3 實驗儀器 離心機（長沙平凡儀器儀表有限公司，TGI6-II），電熱恒溫水箱（浙江省余姚市檢測儀表廠，浙制02810715），酶聯免疫檢測儀（美國熱電芬蘭雷勃酶標儀，型號MK3），全自動γ放射免疫計數器（西安核儀器廠生產，型號FJ-2003/2008PS）。

1.2 實驗方法

60只大鼠先分籠飼養并喂以一般飼料1 w，排除飼食異常者。隨機分為空白對照組、模型組、柳氮磺吡啶組（SASP組）、固本培元方低、中、高劑量組6組，每組10只，雌雄各半。從實驗第1天開始，除空白組予以普通飼料外，動物分籠飼養，自由飲水。模型組按參考文獻［1-2］方法造模：番瀉葉由安徽中醫藥大學第一附屬醫院門診部中藥房提供，用開水浸泡24 h，制成20%浸劑。20%番瀉葉浸劑按每100 g體重1.5 mL灌胃，1次/d，灌服3 d后，禁食不禁水36 h，用戊巴比妥鈉25 mg/kg腹腔注射麻醉，5 g/L肥皂水灌腸；20 min后肛門注入2 mL濃度為50 mL/冰乙酸的液體，動物蘇醒后正常喂養，次日起繼續灌服番瀉葉2 d。自造模第3天開始，低、中、高劑量組按成人用量的 5，10，20 倍計算，即含生藥量 4.6 g/kg，9.2 g/kg，18.3 g/kg，藥物用蒸餾水配成 4.6 g/L，9.2 g/L，18.3 g/L。分別給予不同用藥組相應的藥物治療，每只3 mL/d，模型組灌服等容積的蒸餾水，連續灌服7 d。陽性對照組（柳氮磺胺吡啶組）予以400 mg/kg柳氮磺吡啶溶于0.9%NaCl溶液2 mL中灌胃，連續7 d。

1.3 觀察指標

1.3.1 大鼠癥狀、體征 每天記錄實驗大鼠的一般情況和脾虛癥狀，包括飲食、糞、尿、體質量、皮毛、活動情況、精神狀態等。

1.3.2 病理改變 各組動物采血后脫頸椎處死，取距肛門約8 cm長末端的結腸，沿縱軸剪開，冷生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干，平鋪于冰塊上。根據文獻［3］的方法，進行大體形態損傷評分，后用甲醛固定，石蠟包埋、切片（4 μm），以備HE染色觀察組織學改變。

1.3.3 血清IL-6、IL-8、IL-10及TNF-α 的濃度測定末次灌胃后次日禁食不禁水12 h，造模7 d后，麻醉大鼠，稱重，從心臟采血4 mL，置干燥無菌試管中，室溫靜置自然凝固收縮后，于37℃水浴中孵育20 min。以4000 r/min離心10 min，分離血清，保存于-20℃冰箱，以備檢測血清TNF-α、IL-6、IL-8和IL-10。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠癥狀、體征比較

空白組大鼠強壯活躍，飲食正常，反應靈敏，喜打斗，活動正常，皮毛順滑光澤，大便呈橢圓球狀，體重逐漸增加。模型組自灌服番瀉葉第2至3天，各大鼠即出現不同程度的腹瀉，大便呈糊狀或半糊狀，肛門周圍皮毛污穢，飲水量增多，飲食量略減少，嗜睡懶動。肛門灌入冰乙酸的第2天，各模型組大鼠飲食量明顯減少，豎毛，易脫毛，有的出現腹脹。雄性大鼠陰囊下垂，出現黏液膿血便，消瘦，瞇眼，神態極度萎靡等癥狀，自發活動明顯減少。陽性對照組灌服柳氮磺吡啶后，腹瀉及膿血便的次數逐漸好轉，部分大鼠膿血便消失，飲食量及神態也漸好轉，攝水量明顯降低，至灌服柳氮磺吡啶第5天，有2只大鼠因脫肛脫水而死亡。高、中、低劑量組自灌服新安固本培元方后，體重、飲食及神態明顯恢復，治療1 w后各癥狀基本消失，恢復較柳氮磺吡啶組快。高劑量組在灌服中藥后第2天，便溏即有不同程度改善，小便量明顯增多，自發活動次數明顯增多。

2.2 各組大鼠結腸黏膜病理變化比較

肉眼觀察發現，空白組大鼠結腸黏膜皺襞紋理清晰，色澤淡紅，未見潰瘍面。模型組大鼠結腸黏膜充血、水腫，有潰瘍形成，潰瘍呈灶狀或條狀。SASP組大鼠結腸黏膜輕度水腫，有少數散在未完全愈合的潰瘍灶。高、中劑量組結腸黏膜形態完全正常，潰瘍面基本愈合。低劑量組結腸黏膜僅呈現輕度充血、水腫，潰瘍面已愈合。

2.3 各組大鼠結腸黏膜形態損傷評分、血清IL-6、IL-8、IL-10及TNF-α的濃度的比較

與空白組比較，模型組大鼠血清IL-6、IL-8及TNF-α的濃度及結腸黏膜形態損傷評分明顯升高，IL-10含量顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，SASP組、高、中、低劑量組血清IL-6、IL-8及TNF-α的濃度及結腸黏膜形態損傷評分均明顯下降，IL-10水平顯著升高（P<0.01），且高劑量組降低TNF-α、減輕結腸黏膜損傷的效果優于中、低劑量組（P<0.05）。結果見表1。

3 討論

中醫文獻無潰瘍性結腸炎名稱，根據其臨床特點當屬中醫“泄瀉”“痢疾”“便血”“腸風”等范疇。中醫藥依據整體理論，對本病進行辨證論治，并采用內、外結合的多種方法加以治療，起到調節機體免疫、消除炎癥、改善微循環、促進潰瘍愈合的作用，具有較好的療效。中醫基礎理論認為，“脾主運化”、“泄瀉屬脾”、“泄瀉之本無不由脾胃”等。文獻報道本病的病例中，中醫辨證屬脾虛型占大多數，其臨床表現如納差、腹脹、神疲乏力、腹痛喜按、腸鳴、面色萎黃、舌淡胖有齒痕、脈緩弱等與中醫脾虛泄瀉相近，可見本病證型以脾虛居多［1］。加之現代人們生活節奏加快，心理壓力越來越大，生活水平的提高使膏粱厚味成為誘發UC的重要因素，飲食中各種添加劑甚至農藥超標，都會在不同程度上影響脾胃的生理功能，進一步造成脾胃的病理改變，使脾胃虧虛，飲食水谷不及運化，而生濕、熱、瘀、毒，因此脾虛是UC病程發生發展中的基本病機。

表1 各組大鼠血清IL-6、IL-8、IL-10及TNF-α的濃度結腸黏膜形態損傷評分 （±s）

表1 各組大鼠血清IL-6、IL-8、IL-10及TNF-α的濃度結腸黏膜形態損傷評分 （±s）

注：與空白組比較，1）P<0.01；與模型組比較，2）P<0.01；與高劑量組比較，3）P<0.05

組別 n IL-6（ng/L） IL-8（ng/L） IL-10（ng/L） TNF-α（ng/L） 結腸黏膜形態損傷評分（分）空白組 1025.31±2.0435.25±2.970.89±0.230.79±0.210.62±0.36模型組 1039.67±4.781） 49.32±5.291） 0.64±0.111） 1.79±0.171） 4.78±6.021）SASP 組 832.12±2.012） 40.17±2.212） 0.78±0.412） 1.39±0.192） 3.25±0.452）高劑量組 1026.03±3.022） 36.12±4.012）1.88±0.522）0.91±0.502）1.37±0.132）中劑量組 1029.21±2.012）38.95±3.102）0.97±1.012）1.62±0.412）3）2.35±0.112）3）低劑量組 1031.01±1.782）40.07±2.562）0.80±0.302）1.58±0.232）3）2.46±0.162）3）

新安醫學作為中國傳統醫學的重要組成部分，在中醫的發展史上做出了不可磨滅的貢獻。以汪機為代表的新安醫家師崇金元丹溪、東垣之學，但在學術上尊古而不泥古，在實踐中辨證論治，提出了“調補氣血，固本培元”的治療思想，被后世尊稱為“固本培元”派。

“固本培元”派臨床治療重視脾胃元氣，通過使用參、芪等益氣藥物達到固本培元目的。為了進一步研究新安“固本培元”思想，揭示固本培元理論的現代醫學機制，我們通過對汪機的《石山醫案》用藥規律進行篩選，發現汪氏組方配伍規律：以補氣藥為主要藥物，常用配伍藥物為補血藥、清熱藥、理氣藥、補陰藥、利水滲濕藥等，并確定基本方固本培元方：人參 6 g，黃芪 20 g，白術 15 g，茯苓 12 g，當歸 10 g，白芍 12 g，麥冬 12 g，陳皮 12 g，黃柏 10 g，黃芩 12 g，甘草6 g［2］。該方以四君子湯作為基礎，方以人參大補元氣，黃芪味甘能補，性溫能升，為補氣升陽的要藥，配合人參補脾胃之氣鼓舞清陽；白術苦溫健脾燥濕，助運化，和胃氣，善補后天之本，為補氣健脾之要藥；茯苓甘淡滲濕健脾，參苓術合用，健脾除濕之功更強，促其運化；陳皮辛散苦降，芳香醒脾，長于理氣燥濕健脾，調中快膈；以當歸、白芍調血和營，麥冬清熱，黃柏、黃芩清熱燥濕解毒，甘草甘溫調中。全方共奏補氣健脾、清熱燥濕解毒之功能，該方在臨床上用于潰瘍性結腸炎、慢性淺表性胃炎等疾病辨證屬脾虛者，多獲良效。本課題探討該方對脾虛型潰瘍性結腸炎大鼠模型細胞因子的影響，從現代醫學角度研究該方的作用機制，闡釋其作用機理，為繼承發揚新安醫學做貢獻。

大量研究表明，促炎細胞因子IL-6、IL-8、TNF-α與抗炎細胞因子IL-10相互作用，若其平衡失調導致結腸組織免疫損傷，促進UC形成［3-5］。研究發現，活動性UC血清、結腸黏膜中TNF-α、IL-6、IL-8水平明顯升高，這些細胞因子的表達和分泌與疾病的炎癥程度呈正相關［4］。IL-10是一種強有力的抗炎因子，其主要生物學活性是抑制抗體產生炎癥細胞因子IL-6、IL-8、TNF-α，在維持細胞因子的平衡中起主要的調節作用，使腸黏膜炎癥反應減弱，有利于組織的重建及修復。

本實驗表明，與空白組比較，模型組大鼠血清IL-6、IL-8、TNF-α 水平均升高，而 IL-10的水平顯著降低（P<0.01），說明造模成功。與模型組比較，SASP組、固本培元方各劑量組大鼠結腸黏膜損傷程度減輕，可能與血清 IL-6、IL-8、TNF-α水平降低，IL-10含量明顯升高有關，且固本培元方降低TNF-α水平，減輕黏膜損傷的作用隨劑量增加而增強。由此可見，新安固本培元方對脾虛型大鼠潰瘍性結腸炎有較好的治療作用，適于臨床上進一步推廣、應用。

［1］中國中西醫結合學會消化系統疾病專業委員會.慢性非特異性潰瘍性結腸炎中西結合診斷、辨證和療效標準［J］.中國中西醫結合雜志，2004，14（4）：239.

［2］袁靜.《石山夜話》治療脾氣虛發熱方劑優化整理研究［J］.中國中醫藥信息雜志，2006，27（5）：419-421.

［3］施嫣紅.潰瘍性結腸炎的免疫學研究進展［J］.疾病控制雜志，2006，10（3）：302-304.

［4］路曉紅，楊恩來，趙霞，等.潰瘍性結腸炎免疫機制的研究進展［J］.山西中醫學院學報，2011，12（1）：35-36.

［5］Akazawa A，Sakaida I，Higaki S，et al.Increased expression of tumor necrosis factor-alpha messenger RNA in the intestinal mucosa of inflammatory bowel disease，particularly in patients with disease in the inactive phase［J］.J Gastroenterol，2002，37（5）：345-353.