微生物多糖提取、分離和純化方法的技術策略

張紅兵 胡云霞 趙士豪 狄柯坪 韓 梅

(河北經貿大學生物科學與工程學院，河北 石家莊 050061)

多糖廣泛分布于高等植物、地衣、海藻、動物和微生物中，具有提高免疫力、降血糖、抗腫瘤、抗病毒等多種生物活性，針對一些常見的老年性急慢性疾病具有預防和治療作用。由于微生物具有繁殖能力強、周期短、成本低、易控制的特點，所以普遍采用微生物發酵法生產多糖，其產量及質量穩步提高，性價比也優于動植物來源的多糖。目前，在食品工業中，微生物多糖已作為膠凝劑、成膜劑、保鮮劑、乳化劑等添加劑，廣泛應用于老年保健食品，還有一些微生物胞外多糖及其衍生物具有重要的藥用價值，在生物醫藥領域中受到青睞。

典型的多糖生產工藝流程有如下四個方面〔1〕：①預處理：包括取樣、樣本儲存、樣本的清洗和樣本的均質(其中均質很重要，因為微生物在生長過程中呈膜狀或絮狀，不利于后續工藝，均質可以使樣本細胞充分分散)；②從預處理后的樣品中提取多糖；③多糖的純化；④多糖的分析鑒定。在上述流程中，微生物多糖的提取和純化是多糖研究的基礎和關鍵，也是工藝的核心內容，一般根據樣本特性制訂相應的提取方法。本文將對有關提取及純化新技術成果進行簡要介紹。

1 多糖提取方法的選擇

能夠產生多糖的微生物包括某些細菌、真菌(包括大型食用真菌)和藍藻類，這些多糖主要以三種形式存在：一是黏附在細胞表面；二是分泌于胞外基質；三是構成細胞成分。因此，提取多糖的方法需根據不同存在形式進行選擇。對于可溶性的多糖，尤其是胞外多糖，常采用離心法；而對于結合性多糖，則可以綜合多種不同的提取方法。

理想的多糖提取方法首先應該是效率高，盡量避免造成樣本細胞的裂解(提取胞內多糖除外)，盡可能不破壞多糖結構〔2〕。在實際工作中，常綜合表1中列舉的數種方法，從多糖提取率和雜質含量的高低兩方面進行評判和選擇。

提取率的大小測定比較簡單，而多糖質量的判定多年在學術界存在一些困惑。早年的一些學者〔3〕根據多糖中蛋白和核酸的含量來評價多糖提取時細胞的裂解狀況。然而，近年來的研究認為這種方法并不科學，因為部分多糖分子本身就與蛋白連接，所以蛋白含量僅可參考，而多糖結構中幾乎不含核酸成分，如果提取的多糖中含有大量核酸，則表明提取過程中發生了嚴重的細胞裂解。另外，胞內物質三磷酸腺苷和酶類(如葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)，也常作為細胞裂解標志物〔2〕，通過紫外可見光譜法測量這些物質含量，可推斷所提取多糖的質量。

化學提取法利用添加的化學物質破壞多糖和細胞間的結合力，可加速多糖溶出。比較不同化學方法(CER，HCHO / NaOH，EDTA，戊二醛和堿)提取多糖效率結果顯示〔4〕：CER法總粗糖提取率(158±3) mg/g和HCHO/NaOH法的提取率(150±3)mg/g接近。而堿液提取法總粗糖(其中含有大量的水溶性蛋白質等雜質)提取率比CER法高3倍左右〔5〕，但會造成多糖鏈的斷裂破壞，還會因細胞裂解導致產物的污染。研究發現，當pH>9時，NaOH造成多糖鏈斷裂，隨著pH增加，糖蛋白中的二硫鍵會斷裂，糖醛酸會水解等。上述變化可以用凝膠滲透色譜法或高效液相排阻色譜法進行檢測和評估〔2〕。EDTA法盡管有較高的提取量，細胞裂解程度也低，但殘余的EDTA會污染多糖提取物〔6〕(雖然目前可以用透析法部分去除EDTA)。至于HCHO/NaOH方法，HCHO會導致多糖變性，影響碳水化合物結果的判定〔7，8〕。使用水解酶的方法提取多糖是種溫和而有效的方法，但目前提取效率還不太高〔9〕，加之成本高，限制其使用。目前，CER法具有高效率和細胞低裂解率，后續工藝中樹脂也容易去除，還避免了化學試劑的引入造成多糖污染，利于后續的多糖分析而廣泛受到青睞，成為普遍接受的多糖提取法。

物理提取方法包括超聲波處理、離心、微波處理及加熱等形式，這些方法基本都是利用外力促使多糖從細胞中分離出來并溶解到溶液中達到分離目的，其效率通常比化學法效率低得多。Comte等〔10〕比較了8種提取方法對提取效率的影響，即四種化學方法：CER、EDTA、HCHO/NaOH和戊二醛；二種物理方法：超聲波處理、加熱；一種綜合方法：CER + 超聲波處理；用離心法對照。結果表明：EDTA、HCHO/NaOH和戊二醛等三種化學方法的提取效率(96～318 mg/g)遠遠高于CER、超聲波處理、超聲波處理 + CER、加熱等方法(21～64 mg/g)；對照方法效率則最低(僅為16～21 mg/g)。其中，CER方法比加熱法略高，前者僅比后者效率高1.1～1.6倍〔4〕。物理提取法與化學提取法相比有一些優勢，它僅使多糖分子斷裂，引起多糖分子量大小分布的變化，而不會引入其他化學物，故不影響多糖的高效液相排阻色譜圖譜指紋，有利于對多糖成分和結構的分析〔11〕。

目前，許多學者更傾向于選用綜合方法，即不同方法的有機組合，通常采用超聲波輔助其他物理和化學方法進行提取多糖的工藝參數的優化。優化參數包括提取溫度、提取時間、溶液的pH值、溶劑的種類等〔12，13〕。郭霞等〔14〕采用復合酶超聲波法對桑黃菌絲體多糖提取條件進行了優化，發現提取溫度50℃、pH4.8、料液比1∶80、復合酶酶量5%、酶解60 min，提取率可達6.11%，如果再結合超聲破碎20 min，多糖提取率可達8.576%，分別是熱水提取法、復合酶法和超聲波法等簡單提取法提取率的2.7倍、1.4倍和1.6倍。

目前，從多糖提取效果來看，還不存在一種通用于所有微生物的萬能提取法，只能根據不同樣本特征進行方法選擇和優化，即將幾種提取方案加以比較，反復實驗，不斷修改，直到獲得較滿意效果為止。

2 多糖的分離和純化方法

上述提取物濃縮后加沉淀劑(如乙醇)過夜后離心，沉淀部分再經乙醇分級或超濾分離后，冷凍干燥得到粗多糖。此粗多糖常含有蛋白質、色素、低聚糖、氨基酸等雜質，不僅影響產品的外觀性狀，而且有些大分子物質可能對人體有害(如致敏因子等)，在純化時應先除去，也就是對多糖純化前先進行分離，然后再進一步純化制備純度較高或相對單一的多糖。

2.1多糖的分離 實驗室中常采用蛋白質變性劑、鹽析、透析等方法，也有的實驗室采用層析(包括離子交換層析和親和層析)、凝膠過濾、超濾和電泳法等較先進的方法。見表2。

表1 微生物多糖提取方法和簡明原理

表2 微生物多糖分離方法和簡明原理

在實際操作中，如果采用化學方法除去雜質，應該注意反應過程中可能會產生熔解熱，應給予降溫措施，防止多糖降解；還應該考慮到化學試劑對目標物質造成不同程度損失和破壞，所以操作不易劇烈，而且應盡量避免使用次數過多。實驗室中常用 sevag法除去蛋白，二乙氨基乙基纖維素(DEAE Cellulose)柱層析除去色素，透析法和超濾法除去小分子雜質〔15〕。

2.2多糖的純化和分級 提取液除去色素、單糖、蛋白質等雜質后的多糖仍是多糖混合物，需進一步分離純化為單一多糖，才能完成多糖分級。最常用方法是利用多糖在乙醇中溶解度差異進行分級沉淀分離。也可根據多糖電荷密度不同，用季銨鹽絡合物、電泳、色譜(包括陰、陽離子交換色譜，瓊脂糖或葡聚糖凝膠色譜和高效液相色譜)、層析方法進行純化分級，也可根據多糖分子量大小利用凝膠過濾色譜、超濾等技術進行分級，見表3。

表3 微生物多糖純化分級方法和簡明原理

利用30%～50%乙醇沉淀法純化多糖，此時效率最高，但仍然要注意和多糖的損失和斷裂破壞，而季銨鹽只能與酸性多糖結合，需要注意調整溶液pH值，季銨鹽濃度控制在100～1 000 g/L之間較為適宜。

隨著分析化學技術的提高，目前純化多糖等活性物質更傾向于利用層析法，包括按分子量大小和形狀分離的凝膠柱層析、按多糖極性大小分離的離子交換柱層析和按配體性質分離的親和層析。前兩者需要采用洗脫液進行梯度洗脫，洗脫液為純水、各種濃度的鹽溶液及緩沖液，其離子強度依實驗樣本和分離目標確定。隨著親和技術發展，親和層析分級法逐步成為研究熱點，它具有高度特異性，甚至相同分子量大小的α-葡聚糖(吸附部分)和β-葡聚糖(非吸附部分)都可以區分開來，這是其他方法難以比擬的。Sigma-Aldrich公司已開發了多種含有配體的填料，不同配體與不同的多糖具有親和特異性。如：L2507和L5147兩者用于純化與氧(-O)相連的糖蛋白及含有α-D-半乳糖的糖蛋白；L8775的特異性是直接與末端為α-D-甘露糖殘基的糖復合物非還原端相連接；L4018具有與末端為α-D-甘露糖殘基和α-D葡萄糖基殘基的多糖親和性，用于分離凝膠過濾層析分離后仍然結合在一起的α-和β-葡聚糖〔16〕。至于高效液相色譜(HPLC)法，其機制與層析法相似。

3 小 結

多糖的提取和純化從傳統的溶劑萃取法、乙醇分級法，到酶法、超聲輔助法和微波輔助法及層析、超濾和電泳技術綜合運用，使多糖提取效率和質量都有所提高，但同時提取條件的要求越來越苛刻，儀器成本和提取成本也逐步增加。對于不同用途的多糖，要根據其原料的來源、現具備的條件、多糖使用目的，采用切實可行的提取方法和預處理方法。為了達到最好提取效果，可以將數種提取方法配合起來使用，以獲得較佳結果。

4 參考文獻

1Sheng GP，Yu HQ，Li XY.Extracellular polymeric substances (EPS) of microbial aggregates in biological wastewater treatment systems：a review〔J〕.Biotechnol Adv，2010；28(6)：882-94.

2Frφlund B，Palmgren R，Keiding K,etal.Extraction of extracellular polymers from activated sludge using a cation exchange resin〔J〕.Water Res，1996；30(8)：1749-58.

3Brown MJ，Lester JN.Comparison of bacterial extracellular polymer extraction methods〔J〕.Appl Environ Microbiol，1980；40(2)：179-85.

4Domínguez L，Rodríguez M，Prats D.Effect of different extraction methods on bound EPS from MBR sludges.Part I：Influence of extraction methods over three-dimensional EEM fluorescence spectroscopy fingerprint〔J〕. Desalination，2010；261(1-2)：19-26.

5Garcia Becerra FY，Acosta EJ，Allen DG. Alkaline extraction of wastewater activated sludge biosolids〔J〕.Bioresour Technol，2010；101(18)：6983-91.

6Comte S，Guibaud G，Baudu M.Biosorption properties of extracellular polymeric substances (EPS) resulting from activated sludge according to their type：Soluble or bound〔J〕.Pro Biochem，2006；41(4)：815-23.

7Bala Subramanian S，Yan S，Tyagi RD,etal. Extracellular polymeric substances(EPS) producing bacterial strains of municipal wastewater sludge: isolation, molecular identification, EPS characterization and performance for sludge settling and dewatering〔J〕. Water Res，2010；44(7)：2253-66.

8Sheng GP，Yu HQ，Yu Z.Extraction of extracellular polymeric substances from the photosynthetic bacterium Rhodopseudomonas acidophila〔J〕. Appl Microbiol Biotechnol，2005；67(1)：125-30.

9Sesay ML，?zcengiz G，Dilek Sanin F.Enzymatic extraction of activated sludge extracellular polymers and implications on bioflocculation〔J〕. Water Res，2006；40(7)：1359-66.

10Comte S，Guibaud G，Baudu M.Relations between extraction protocols for activated sludge extracellular polymeric substances (EPS) and EPS complexation properties：Part I.Comparison of the efficiency of eight EPS extraction methods〔J〕.Enzyme Micr Technol，2006；38(1-2)：237-45.

11Comte S，Guibaud G，Baudu M.Effect of extraction method on EPS from activated sludge：an HPSEC investigation〔J〕.J Hazard Mater，2007；140(1-2)：129-37.

12Deng P，Zhang G，Zhou B,etal.Extraction and in vitro antioxidant activity of intracellular polysaccharide by Pholiota adiposa SX-02〔J〕.J Biosci Bioeng，2011；111(1)：50-4.

13Erden G，Demir O，Filibeli A.Disintegration of biological sludge：Effect of ozone oxidation and ultrasonic treatment on aerobic digestibility〔J〕. Bioresour Technol，2010；101(21)：8093-8.

14郭 霞，鄒 祥，孫 敏.桑黃菌絲體多糖提取方法比較及優化研究〔J〕.食用菌，2009；31(3)：62-4.

15鞠 海，張建民，魏 鋒,等.天然多糖的分離、純化和結構鑒定〔J〕.國外醫藥·植物藥分冊，2000；15(3)：107-13.

16Zhang M，Cui SW，Cheung PCK,etal.Antitumor polysaccharides from mushrooms：a review on their isolation process，structural characteristics and antitumor activity〔J〕.Trends Food Sci Technol，2007；18(1)：4-19.