反相高效液相色譜—串聯質譜法測定母乳及奶粉中核苷和核苷酸的含量

張婷婷等

摘要：建立了反相高效液相色譜串聯質譜法測定母乳和嬰幼兒奶粉中5種核苷和5種核苷酸含量的方法。樣品經溫水溶解后，選擇0.5 %乙酸沉淀蛋白，并用超濾離心管離心過濾大分子物質；采用鍵合較長碳鏈的Acclaim C30色譜柱為分析柱，以20 mmol/L醋酸銨和乙腈為流動相，梯度洗脫分離，流速0.4 mL/min，溫度15 ℃，紫外檢測波長260 nm，采用電噴霧正離子模式進行電離，選擇反應監測模式進行檢測，外標法定量分析。結果表明，核苷和核苷酸在12 min內達到基線分離，在0.02～100 mg/L范圍內，線性關系好，相關系數R>0.999，方法檢出限0.1～0.2 ng，其中CMP， UMP， GMP， U， AMP在1， 10和50 mg/L加標水平下的平均回收率在85.2%～104.7%之間，峰面積RSD在0.7 %～2.0%之間（n=6），核苷C， I ， G ， A和核苷酸IMP在0.5， 5和10 mg/L加標水平下的平均回收率在85.08%～103.7%之間，峰面積RSD在0.6%～1.7%之間（n=6）。應用本方法定性和定量分析母乳和嬰幼兒奶粉中核苷和核苷酸的含量，并且對紫外和質譜測定的結果進行比較，基本一致。

關鍵詞：液相色譜；質譜；核苷；核苷酸；母乳；奶粉

1引言

核苷是由堿基加上環狀核糖或脫氧核糖組成，包括腺苷、鳥苷、胞苷、尿苷、肌苷等（圖1）。核苷與磷酸以酯鍵連成核苷酸，成為核酸的組成單位。研究表明，攝入適量的核苷和核苷酸能夠有效降低腹瀉的風險、保持體內微生物環境的平衡、提高免疫功能和調控脂質代謝等[1～4]。母乳中含有多種核苷和核苷酸，而牛奶中一般不含有核苷和核苷酸，因此許多奶制品公司將核苷酸作為重要的添加劑。臨床研究顯示，嬰幼兒奶粉中添加適量的核苷酸，有助于較小嬰兒腸胃的生長發育[5]。目前，嬰幼兒奶粉中5種核苷酸（AMP， GMP， UMP， CMP和IMP）的含量有國際標準，歐盟規定嬰兒食品中核苷酸的總含量不超過5 mg/100 kcal，而美國規定的含量上限為16 mg/100 kcal[6，7]。研究者希望深入研究母乳中各種核苷和核苷酸的含量，以此為基礎，生產出各項指標更加接近母乳的嬰幼兒奶粉，促進嬰幼兒更健康地生長。

目前，測定核苷酸的方法包括熒光法[8]、毛細管電泳法[9，10]、離子交換色譜法[11]、反相高效液相色譜法（RPHPLC）[12]、液相色譜質譜法[13～15]等。比色法易受干擾，操作比較復雜；毛細管電泳測定結果的重現性不好；離子色譜分離核苷酸結果較好，受基質干擾較少，但是流動相與質譜不兼容；液相色譜方法操作簡單，分析速度快，重現性較好，但是核苷酸極性較強，在常規反相色譜柱上保留較弱，而嬰幼兒奶粉基質又比較復雜，容易受到基質干擾[16]。

本研究采用Acclaim C30色譜柱，其具有比C18填料更長的疏水性碳鏈，對各種核苷和核苷酸具有更高的分辨率，同時增加了疏水性較弱的胞嘧啶核苷酸與色譜固定相的作用力，避免復雜基質的干擾。以此為基礎，建立了反相高效液相色譜串聯質譜法測定5種核苷和5種核苷酸（結構式見圖1）的分析方法，并應用于母乳和嬰幼兒奶粉的含量測定中。本方法快速，靈敏度高，適合于復雜基質樣品的分析。

3.5樣品測定

按照2.4節樣品前處理和2.2節色譜條件進行測定，外標法定量分析。分別采用紫外和質譜定量分析某品牌奶粉和母乳中核苷和核苷酸的含量，結果見表6，兩種方法的測定結果一致。結果表明，本方法快速、靈敏度高，可用于對母乳和嬰幼兒奶粉中核苷和核苷酸含量的測定，確保核苷和核苷酸在嬰幼兒奶粉中的添加量在合理范圍內，接近或達到母乳的功效。

References

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