2-脫氧-D-葡萄糖對人臍靜脈內皮細胞的作用

程 靜， 張冠華， 易成剛， 余 州， 宋雅娟， 楊 力

2-脫氧-D-葡萄糖對人臍靜脈內皮細胞的作用

程 靜， 張冠華， 易成剛， 余 州， 宋雅娟， 楊 力

目的觀察2-脫氧-D-葡萄糖對人臍靜脈內皮細胞增殖、遷移、管腔形成及細胞凋亡的影響，試圖尋找治療血管瘤的新藥。方法用四甲基偶氮唑鹽比色法、倒置顯微鏡下形態學觀察、體外劃痕實驗的方法，觀察2-脫氧-D-葡萄糖對人臍靜脈內皮細增殖、遷移的作用；用成管法，檢測2-DG對血管形成的影響；用流式細胞儀檢測2-DG對血管內皮的凋亡影響。結果2-DG作用于人臍靜脈內皮細胞后，對其增殖，遷移和成管能力有明顯抑制作用，大大地增加細胞的凋亡率，且有顯著劑量和時間依賴性。結論2-DG對HUVEC增殖、遷移和成管有顯著的抑制作用,且能促使細胞凋亡。

2-脫氧-D-葡萄糖； 臍靜脈內皮細胞； 血管瘤

血管瘤是嬰幼兒最常見的先天性良性腫瘤，1歲以下發病率約為10%，早產兒或低體質量新生兒發病率可高達22%～30%[1]。血管瘤可發生于全身各處，約60%發生于頭頸部。嚴重影響美觀，甚至影響生理功能，威脅生命[2-3]。血管瘤的臨床治療包括激光、普萘洛爾等多種方法[4-5]。2-脫氧-D-葡萄糖(2-deoxy-glucose, 2-DG)是一種葡萄糖類似物，除了c-2端的-OH被-H取代外，其余結構與葡萄糖一致，它可以抑制內皮細胞的糖酵解途徑和抑制其N-連接糖基化作用(R Datema, 1979年)[6]，從而影響腫瘤生長的多個環節。血管瘤是以血管內皮細胞異常增殖為主要病理特征的良性血管病變[7]，人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)和血管內皮細胞有相似的特性。我們利用HUVECs進行初步研究，觀察2-DG對HUVECs增殖、遷移、成管及凋亡的作用。

1 對象與方法

1.1 主要材料 2-DG(美國SIGMA公司)；人臍靜脈內皮細胞株(北京清源浩生物公司)；ECM培養基(美國SCIENCELL公司)；胎牛血清、胰蛋白酶、二甲基亞砜(美國GIBCO公司)；DMSO、MTT(美國SIGMA公司)；Matrigel、流式細胞儀(美國BD公司)；Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒(北京寶賽生物技術有限公司)；倒置顯微鏡(日本NIKON公司)。

1.2 分組 本實驗分為空白對照組和2-DG試驗組，試驗組按照2-DG的濃度分為0.06、0.6、6、9 mM 2-DG處理組。

1.3 HUVECs的培養與傳代 HUVEC購自北京清源浩生物公司，接種于T-75培養瓶(poly-l-lysine包被)內，加入ECM培養基，置于37 ℃，5%CO2的培養箱內，培養至細胞密度為90%時，用Trypsin-EDTA消化成細胞懸液，再傳代于T-75培養瓶內，繼續培養。將培養至3～6代的細胞用于實驗。

1.4 四甲基偶氮唑鹽比色法檢測2-DG對HUVECs細胞增殖活性的影響 將HUVECs經Trypsin-EDTA消化后制成細胞懸液，記數，按每孔104個細胞接種于96孔培養板內，共接種9塊板。常規培養24 h，待其貼壁后，向對照組和實驗組分別加入0、0.06、0.6、6、9 mM 2-DG，繼續常規培養，分別于第1～9天各取出一塊板，每孔加入20 μl MTT，再放入孵箱中繼續孵育4 h時，取出后吸掉孔內上清液，加入150 μl DMSO，震蕩10 min，在酶聯免疫儀上選擇490 nm波長測各孔的吸光度值(OD值)。

1.5 倒置顯微鏡細胞形態學觀察2-DG對HUVECs細胞生長和形態的影響 取對數生長的HUVECs，經Trypsin-EDTA消化后接種于用六孔板(poly-l-lysine包被)中，常規培養24 h，待細胞密度為90%，向對照組和實驗組分別加入0、0.06、0.6、6、9 mM 2-DG，放入孵箱中繼續培養，分別于0、24、48 h用OLYMPUS倒置顯微鏡拍照，觀察細胞數量和形態變化。

1.6 體外劃痕法檢測2-DG對HUVECs遷移能力的影響 取對數生長的HUVECs，消化并接種到6孔板(poly-l-lysine包被)中，常規培養，待細胞密度為90%時，向每孔內加入20 μl絲裂霉素C，繼續常規培養2 h，取出后用滅菌的1 ml槍頭在每孔中心劃十字線，吸掉培養基，用PBS液洗兩遍，向對照組和實驗組分別加入0、0.06、0.6、6、9 mM 2-DG，放入孵箱中培養，于0、12 h用OLYMPUS倒置顯微鏡拍照，統計。

1.7 Matrigel成管法檢測檢測2-DG對HUVECs成管能力的影響 用槍頭(預冷)吸取50 μl Matrigel均勻鋪到96孔板(預冷)中，放入培養箱，放置30 min，使Matrigel凝固后取出。取對數生長的HUVECs，消化后制成1×104/ml的細胞懸液，按每孔50 μl將其加入96孔板，向對照組和實驗組分別加入0、0.06、0.6、6、9 mM 2-DG，繼續常規培養，在0、12 h取出，用OLYMPUS倒置顯微鏡拍照，統計。

1.8 流式細胞儀檢測2-DG對HUVECs凋亡影響

取對數生長的HUVECs，消化并接種于6孔板中，常規培養，待細胞密度為90%時，向對照組和實驗組分別加入0、0.06、0.6、6、9 mM 2-DG，繼續常規培養24 h，取出并消化，收集到15 ml離心管中離心(800 r/min，5 min)，棄上清，用預冷的PBS洗2遍后再離心，取出用Bing Buffer(結合液)重懸細胞，調整細胞濃度為1×104/ml，置入流式專用管中，分別加入5 μl FITC Annexin V和5 μl PI進行處理，輕輕混勻細胞，室溫避光孵育15 min，取出，每管加入400 μl Bing Buffer，用流式細胞儀檢測并分析。

1.9 統計學處理 數據用SPSS 12.0統計軟件處理分析，組間比較t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MTT比色法檢測2-DG對HUVECs活力的影響 用不同濃度2-DG處理HUVECs 72 h后取出，測得其在490 nm波長處的OD值，與對照組相比，HUVECs的細胞活力隨著2-DG劑量的增加逐漸減小，0.06 mM 2-DG處理組只能小幅度抑制HUVECs的活力，而0.6 mM 2-DG處理組的細胞活力為49.6%，有明顯的抑制作用；6、9 mM 2-DG處理組的抑制程度更加明顯，均在60%以上。

2.2 倒置顯微鏡細胞形態學觀察2-DG對HUVECs細胞數量和形態的影響 用不同濃度2-DG處理HUVECs，分別于0、24、48 h用OLYMPUS倒置顯微鏡拍照，觀察細胞的數量和形態變化。對照組細胞生長良好，呈梭型，邊界清楚，排列緊密，貼壁牢固，胞漿豐富，內含小顆粒，呈鋪路石樣生長，隨著時間的變化，細胞形態和數量均無明顯變化。實驗組中，0.6 mM 2-DG作用HUVECs 24 h，細胞數量略少，細胞內出現發泡現象，體積變小，細胞質收縮，間隙增大，細胞形態發生少許變化，且少量細胞脫落和損傷；作用48 h，細胞數量明顯減少，形態變化更加明顯，且大量細胞受損脫落。隨著2-DG濃度的增加或隨著作用時間的延長，細胞數量減少且形態發生更加明顯的變化。

2.3 2-DG抑制HUVECs的遷移能力 細胞遷移是血管瘤生長中內皮細胞血管形成重要的環節。12 h后對照組細胞已遷移至劃痕區域(虛線內)，幾乎爬滿整個劃痕區域(圖1)，而9 mM 2-DG處理組僅有極少量細胞發生遷移(圖2)。0.06 mM 2-DG處理組細胞遷移抑制率為26.4%，有統計學意義，隨著2-DG劑量增大，抑制率隨之增大， 6 mM 2-DG處理組細胞遷移抑制率大大增加，已超過50%(圖3)。

2.4 2-DG抑制HUVECs的成管能力 HUVECs在Matrigel中能自發形成毛細血管狀結構。對照組中HUVECs經過12 h可自發形成連接在一起的微管，而9 mM 2-DG處理組形成微管的能力較差，統計結果表明該濃度能顯著抑制HUVECs的成管能力，低劑量2-DG處理組也能不同程度的抑制HUVECs微管形成。

2.5 流式細胞儀法測2-DG對HUVECs的凋亡影響影響 誘導內皮細胞凋亡是抑制血管瘤內皮細胞增殖的重要環節，本實驗用Annexin V 和PI 雙染色法通過流式細胞儀來分析2-DG對HUVECs的凋亡影響，如圖4所示， 2-DG能誘導HUVECs的細胞凋亡，且隨著2-DG劑量的增大HUVECs凋亡細胞的數量也隨之增多，對照組細胞凋亡率為10.63%,0.6 mM 2-DG處理組比對照組上升4.77%，差異有統計學意義(P<0.01)，6 mM和9 mM 2-DG處理組誘導細胞凋亡更加明顯，凋亡率為21.77%和25.07%，比對照組上升了1倍多。

3 討論

目前，血管瘤的病因有溶性細胞因子學說、基因突變學說、細胞凋亡學說、血管內皮祖細胞學說和缺氧學說等幾種假說[8]，但發病機制尚未確切，臨床上多為經驗性用藥和對癥性治療，并無特效的根治方法。2-DG可以抑制多種腫瘤細胞的增殖、遷移和分化，且已經進入臨床實驗階段，在腫瘤細胞中2-DG 主要通過以下兩個方面來發揮作用：一方面，在缺氧的條件下，2-DG主要通過競爭性的抑制磷酸葡萄糖異構酶來抑制糖酵解途徑，阻斷了細胞獲得ATP的主要來源，從而阻止細胞的快速增殖、遷移和分化；另一方面，無論是在有氧還是無氧的條件下，2-DG可通過抑制細胞的N-連接糖基化作用來抑制細胞的增殖、遷移和分化。2-DG聯合化療的抗腫瘤作用已被體內、體外實驗證實(RI Aft, 2002年)[9-11]， 2004年，有學者通過臨床試驗證實2-DG與多烯紫杉醇聯合治療實體瘤細胞的效果遠遠高于單獨應用多烯紫杉醇[12]。在小鼠異種移植瘤模型和臨床試驗中，2-DG與放療結合的療效明顯高于放療單獨作用的效果[13]，口服2-DG的安全性和可行性也已經在腫瘤病人的早期臨床治療中得到驗證[14]。

本實驗通過2-DG體外細胞試驗的檢測，發現2-DG能顯著抑制HUVECs的增殖、遷移和成管，使細胞形態發生明顯改變，同時能誘導HUVECs的凋亡。在2-DG作用12 h時，可觀察到2-DG有明顯的抑制HUVECs成管和遷移的作用，在6 mM 2-DG作用下， HUVECs基本上不能形成管腔結構，當增加藥物濃度時，鏡下僅能觀察到些許細胞團塊；細胞處理12 h后，在鏡下觀察細胞的遷移情況時發現，對照組細胞基本爬滿整個視野，而經6 mM 2-DG處理的實驗組，細胞遷移率不超過50%。在2-DG作用24 h時，通過流式細胞試驗檢測凋亡蛋白，說明2-DG可以誘導細胞的凋亡，且隨著劑量的增加，凋亡細胞所占比例也隨之增大。通過細胞形態試驗和MTT比色試驗，發現隨著時間的推移，活細胞的數量逐漸減少，形態亦發生顯著改變，HUVECs體積變小、細胞質收縮，細胞膜尚完整，但細胞內可觀察到發泡現象。在2-DG作用48 h時，HUVECs經0.6 mM 2-DG處理后，在OLYMPUS倒置顯微鏡下僅能觀察到少量細胞存活，大部分細胞與孔板底部分離、脫落，隨著2-DG濃度的增大，凋亡和壞死的細胞增多，活細胞數量更少，且有明顯的細胞損傷。

圖1 對照組12 h后細胞遷移情況圖2 9 mM 2-DG處理組12 h后細胞遷移情況圖3 對照組與實驗組12 h后的細胞遷移抑制率圖4 對照組與實驗組12 h后HUVECs的細胞凋亡率

Fig1 HUVECs cell migration in control group at 12 hours.Fig2 HUVECs cell migration in 9 mM 2-DG treated group at 12 hours.Fig3 Inhibition ratio (percentage) at 12 hours in the experimental and the control groups after 12 hours.Fig4 Apoptosis ratio (percentage) at 12 hours in the experimental and the control groups.

本研究結果顯示，2-DG對HUVECs的增殖、遷移和管腔形成有明顯的抑制作用，且能誘導其凋亡。為將2-DG用于血管瘤的防治進行了初步的探索。

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Effectof2-Deoxy-D-glucoseonhumanumbilicalveinendothelialcell

CHENGJing,ZHANGGuan-hua,YICheng-gang,etal.
(InstituteofPlasticSurgery,XiJingHospital,TheFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi′an710032,China)

ObjectiveTo explore the effects of 2 Deoxy D glucose on the proliferation, migration, capillary formation and apoptosis of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs), searching a new medicine for hemangioma.MethodsMTT ,morphorlogical test and scratch test were used to detect HUVECs proliferation rate and mirgrating ability after 2-DG treatment. Tube formation matrigel assay and flow cytometry were performed for the capillary formation and endothelial apoptosis after the drug intervention respectively.ResultsAfter 2-DG was applied to HUVECs, the proliferation, migration, tube formation of HUVECs were inhibited significantly. The apoptosis rate of these cells increased and was highly time and dosage dependent.Conclusion2-DG inflicts negative effects on the proliferation and capillary formation of HUVECs, and induces apoptosis of HUVECs.

2-deoxy-glucose; Human umbilical vein endothelial cell； Hemangioma

10.3969/j.issn.1673-7040.2014.04.020

R732.2

A

1673-7040(2014)04-0248-04

2013-10-31)

710032 陜西 西安，第四軍醫大學西京醫院 全軍整形外科研究所

程 靜(1987-)，女，陜西咸陽人，住院醫師，碩士研究生.

楊 力，710032，第四軍醫大學西京醫院 全軍整形外科研究所，電子信箱：yangli@fmmu.edu.cn