BVDV1型和2型焦磷酸測序檢測方法的建立

劉海生，張永強，趙永剛，吳延功，王清華，任煒杰，呂 艷，劉春菊，王志亮，單 虎

（1.青島農業大學山東省獸藥診斷試劑工程技術研究中心山東省高校預防獸醫學重點試驗室，山東 青島 266109；2.中國動物衛生與流行病學中心，山東 青島 266032）

牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）屬于黃病毒科，瘟病毒屬，同屬成員還包括豬瘟病毒（CSFV）和羊邊界病毒（BDV）。根據病毒5'-UTR基因序列可將BVDV分為BVDV 1型和BVDV 2型。

牛病毒性腹瀉/黏膜病是BVDV引起的以牛發熱、黏膜糜爛潰瘍、白細胞減少、腹瀉、咳嗽及懷孕母牛流產或產出畸形胎兒為主要特征的傳染病。BVDV已被國內外廣泛地研究報道，致病型BVDV 1常在免疫過疫苗的牛群中引起一過性發熱和下痢，BVDV 2型的強毒株常引起牛急性感染，表現為發燒、腹瀉、血小板減少癥、出血、呼吸失調、高流產率和高死亡率，另外，它還能引起懷孕后期母牛的流產、死胎和新生小牛的先天畸形、免疫抑制等[1-3]。持續感染牛（PI）是BVDV在牛群中持續存在和突然暴發的主要原因。PI牛除了引起奶牛腹瀉、流產外，與正常牛相比，還會出現體重增重減少、繁殖率大大降低、死亡率高、奶牛屢配不孕等情況。BVD的存在會給牧場造成極大的經濟損失[4]，嚴重影響著畜牧業的發展。

BVDV的診斷方法主要有病毒的分離鑒定，ELISA和real-time RT-PCR等方法。病毒分離鑒定是BVDV的經典診斷方法，但存在操作繁瑣，診斷時間較長（1周或更長時間）等不足。ELISA抗原檢測方法具有特異性強、重復性好等特點，同時具有敏感性差等缺點，不能檢測出牛的BVDV一過性感染。real-time RT-PCR是BVDV常用的病原檢測和分型方法，國外已經建立了雙重熒光real time RT-PCR檢測方法[5]，但是存在易污染，出現假陽性等問題。本研究建立的BVDV 1型和2型焦磷酸測序檢測方法能直接讀取檢測樣品的基因序列，實現快速確診BVDV，對于BVDV的分型、流行病學調查以及凈化具有重要意義。

1 材料

1.1 病毒和樣品 BVDV-BA株，購自中國獸醫藥品監察所；牛冠狀病毒（BCV）、牛輪狀病毒(BRV)、牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)、牛病毒腹瀉病毒2型（BVDV2）和豬瘟病毒（CSFV）由中國動物衛生與流行病學中心保存，腸出血性大腸桿菌(EHEC)由青島農業大學保存，天津某規?；膛?6份抗凝血樣品。

1.2 主要試劑和儀器 Transcriptor One-Step RTPCR Kit，High Pure Viral RNA Kit，購自 Roche 公司；IDEXX BVDV Ag Serum Plus病原檢測試劑盒，購自IDEXX公司；Pyro Gold SQA Reagents 1×96 Pyromark ID，購自Biotage AB公司；PyroMark Q96 MD儀器，購自QIAGEN公司。

2 方法

2.1 引物設計 根據GenBank中BVDV 1、BVDV 2和BDV的5′-UTR基因序列，運用PSQ Assay Design軟件分析，設計一對通用擴增引物和分別針對BVDV1和2型的兩條測序引物，其中通用引物的下游引物在5端采用生物素標記。引物均從上海生工生物工程技術服務有限公司合成。本研究中所用的引物及其序列詳見表1、表2。

表1 擴增引物的序列

表2 測序引物及序列

2.2 RNA提取 采用Roche公司生產的High Pure Viral RNA Kit提取BVDV-BA、BVDV-2、BCV、BRV、IBRV和CSFV的RNA。使用煮沸裂解法提取腸出血性大腸桿菌(EHEC)和腸炎沙門菌的DNA。提取的核酸立即用于RT-PCR擴增或置-80℃保存。

2.3 RT-PCR擴增條件優化和待測樣品制備 以提取的病毒RNA為模板，不同退火溫度梯度進行RT-PCR反應，取5 μL擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

以最優反應條件，分別以BVDV 1型和2型核酸為模板進行RT-PCR，擴增產物分為2份，1份用于焦磷酸測序，另1份送交測序公司測序。

2.4 焦磷酸測序反應

2.4.1 測序單鏈模板的制備 根據Gene Company Limited公司的焦磷酸測序反應操作說明書制備測序單鏈模板。將45 μL RT-PCR單鏈模板分別加入到PSQ 96板的兩個孔中，其中一個孔含有45 μL 1型測序引物，另一個孔含有45 μL 2型測序引物，并在85℃的烘箱中放置2 min，取出冷卻后就可進行焦磷酸測序。

2.4.2 測序反應 根據PSQTM 96MA System儀器的軟件說明書在試劑艙中分別加入的底物APS、dNTP和酶混合物(DNA聚合酶、熒光素酶、ATP硫酸化酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶)；然后將試劑艙和PSQ 96板放入PSQ TM 96 MD Sys tem儀器中，進行Pyrosequencing反應。

2.5 特異性試驗 以BVDV-BA、BVDV-2、BCV、BRV、IBRV、CSFV、EHEC和Salmonella enteritidis的核酸為模板，用優化好的RT-PCR反應條件進行擴增，取5 μL擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

用1型和2型測序引物分別對上述RT-PCR產物進行焦磷酸測序反應。

2.6 重復性試驗 將擴增的RT-PCR產物分別進行3次焦磷酸測序，比較每次測得的序列結果，確定試驗的重復性和穩定性。

2.7 焦磷酸測序檢測方法在臨床樣品上的應用

從牛場采集86份抗凝血，使用Roche公司生產的High Pure Viral RNA Kit提取RNA，進行RT-PCR擴增，取5 μL進行凝膠電泳鑒定，陽性樣品進行焦磷酸測序。同時使用BVDV Ag Serum Plus檢測86份樣品，將陽性樣品提取核酸，使用文獻[6]中引物進行RTPCR擴增，將擴增結果送交公司測序。

3 結果

3.1 RT-PCR擴增條件優化結果 優化后的RTPCR反應條件為：50℃反轉錄30 min；94℃預變性7 min；94 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，68 ℃ 15 s，45個循環；68℃ 7 min。

3.2 RT-PCR反應 采用擴增引物對BVDV 1和2型2株病毒進行RT-PCR擴增，結果均能擴增出與目的條帶大小相符的特異性條帶（圖1）。

3.3 焦磷酸測序反應 BVDV 1和2型的焦磷酸測序反應每次均能測序到30個堿基以上，完全能用于BVDV的快速鑒定和分型。焦磷酸測序結果與普通測序結果完全一致，符合率為100%，序列測定結果圖略；證明該試驗具有很好的特異性（圖2）。

3.4 特異性鑒定結果 以BCV、BRV、IBRV、CSFV、EHEC和沙門菌的核酸為模板的RT-PCR電泳結果沒有條帶，以BVDV 1型和2型為模板的RTPCR電泳結果顯示有惟一目的條帶，大小符合預期（圖3）。

在焦磷酸測序儀中1型測序引物只與1型的RT-PCR產物結合，2型測序引物只與2型的RTPCR產物結合。本試驗具有良好的特意性。

3.5 重復性試驗結果 對每個RT-PCR產物進行3次重復性檢測，檢測的結果均一致，證明該方法有很好的重復性與穩定性。

3.6 焦磷酸測序檢測方法在臨床樣品上的應用結果 對86份樣品進行焦磷酸測序，結果顯示，有2份BVDV 1型陽性（圖4），沒有BVDV 2型。與IDEXX BVDV Ag Serum Plus檢測的陽性樣品測序結果一致。說明該奶牛場感染了BVDV 1型。

4 討論

BVDV能引起牛腹瀉、血小板減少、繁殖障礙、免疫耐受等癥狀，甚至可以引發黏膜病，給世界養牛業帶來了巨大的經濟損失。PI牛是牛場中的主要危害，PI牛能長期帶毒、排毒，部分PI牛無典型臨床癥狀，嚴重影響了牛群中PI牛的清除工作。

陳備娟等（2010）對我國11個省市的規模奶牛場進行BVDV感染情況的調查，抽樣檢測了57個規模奶牛場的大缸奶樣，抗體陽性的場有48個，陽性率為84.2%，表明了BVDV在奶牛場具有非常高的感染率[7]。我國需要建立一種準確、快速、高通量的檢測方法，用于牛群中BVDV的檢測和凈化。

焦磷酸測序技術(Pyrosequencing)是近年發展起來的一種能夠通過對基因序列測序實現檢測和確診的新型檢測技術，具有高通量、快速、敏感等特點[8]，與普通RT-PCR和real time RT-PCR等檢測技術相比，本技術無需將PCR產物送交公司測序以便確診，從而大大減少了病原確診時間。目前該技術在人乳頭瘤病毒和單純皰疹病毒快速分型上已得到成功應用。

本研究比對了GenBank中絕大多數BVDV 5′UTR序列，設計的擴增引物為BVDV通用引物，能同時擴增出BVDV 1和2型的目的基因片段。針對BVDV1和2型分別設計的測序引物有12個堿基不同，不能與另外1個型發生非特異性結合，但與本型毒株則能很好的結合，具有良好的特異性。由于此方法得到的數據為基因序列圖譜，排除了結果為CSFV或BDV的假陽性。本試驗發現，在測序反應中，將測序引物濃度從0.3 mol/L調至0.6 mol/L時，能得到峰值更高的圖形與結果。

焦磷酸測序方法對PCR擴增產物的濃度與純度有一定的要求，因此該方法的敏感性低于國外常用的熒光定量分型方法。一過性感染BVDV牛的早期和末期，由于血液中病毒含量少，該方法存在漏檢的可能性。但是PI牛長期大量的排毒，病毒含量高，該方法完全可以用于牛場持續性感染牛（PI）的凈化。

此外，使用IDEXX BVDV Ag Serum Plus對某奶牛場的86份抗凝血進行了檢測，將陽性結果的抗凝血提取核酸，RT-PCR擴增，并送到公司測序。得到的測序結果與焦磷酸測序結果一致，對序列進行進化樹分析顯示，2份陽性病料均為BVDV 1型。

[1]Corapi W V，French T W，Dubovi E J.Severe thrombocytopenia in young calves experimentally infected with non-cytopathic bovine viral diarrhea virus[J].J Virol，1989，63:3934-3943.

[2]Ridpath J F，Bolin S R，Dubovi E J.Segregation of bovineviral diarrhea virus into genotypes[J].Virology，1994，205:66-74.

[3]Carman S，van Dreumel T，Ridpath J，et al.Severe acute bovine viral diarrhea in Ontario1998[J].J Vet Diagn Invest，1998，10（1）:27-35.

[4]Houe H.Economic impact of BVDV infection in dairies[J].Biologicals，2003，31:137-143.

[5]Willoughby K，Valdazo-González B，Maley M，et al.Development of a real time RT-PCR to detect and type ovine pestiviruses[J].J Virol Methods，2006，132(1):187-194.

[6]Charles P，Jacqveline L，Peter T，et al.Identification of a new group of bovine viral diarrhea virus strains associated with severe outbreaks and high mortalities[J].Virology，1994，203:260-268.

[7]陳備娟，高全新，朱毅興，等.利用耳組織、血液、牛奶樣品檢測牛病毒性腹瀉病毒的比較[J].中國奶牛，2010（6）:6-8.

[8]Elahi E，Ronaghi M.Pyrosequencing:a tool for DNA sequencing analysis[J].Methods in molecular biology，2004，255:211-219．