雞白痢沙門菌對四環素類藥物耐藥性和耐藥基因調查分析

寧家寶，梁梓森，陳建紅，張濟培，涂玉蓉，司興奎，牛 森

（1.華南農業大學獸醫學院，廣東 廣州 510642；2.佛山科學技術學院動物醫學系，廣東 佛山，528231）

雞白?。≒D）是由雞白痢沙門菌引起雞的一種以雛雞白痢，母雞卵巢炎為特征的典型經卵垂直傳播傳染病。該病不但給養雞業帶來嚴重的危害，造成巨大的經濟損失，同時雞白痢沙門菌可在家禽腸道內定植，在加工禽胴體時會污染肉質，繼而進入人類的食物鏈。四環素作為獸醫臨床上最為常用的抗菌藥物之一，廣泛的應用甚至濫用直接導致了雞白痢沙門菌對四環素類藥物產生耐藥性。雞白痢沙門菌對四環素產生耐藥跟其攜帶的四環素耐藥基因有關，目前國內各地區對雞白痢沙門菌對四環素耐藥性及耐藥基因攜帶情況的研究資料相對較少，為了更好地預防和治療雞白痢沙門菌病和保障公共衛生安全，很有必要加強相關研究。本課題檢測分析了珠三角地區69株雞白痢沙門菌對四環素的耐藥性和四環素耐藥基因攜帶情況，目的為闡明雞白痢沙門菌對四環素的耐藥機制提供更為豐富的科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 69株雞白痢沙門菌，于2005年7月至2011年7月自珠三角地區雞群分離，利用本實驗室建立的雞白痢沙門菌PCR方法[1]進行鑒定并保存。藥敏質控菌大腸埃希菌ATCC25922，購自美國典型菌種保藏中心。

1.1.2 藥品與試劑 四環素為AMRESCO公司產品；pMD18-T Vector、premix Ex Taq酶等均為寶生物工程（大連）有限公司產品；瓊脂粉和SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒為上海生工生物工程技術服務有限公司產品；LB肉湯粉和木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD）瓊脂粉均為廣東環凱微生物科技有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 菌株的復蘇 取-40℃保存的菌種劃線接種于XLD固體培養基上，于37℃培養16 h；挑取單個典型菌落接種于LB液體培養基中，置于37℃搖床過夜培養。

1.2.2 耐藥性的檢測 根據CLSI制定的試驗方法和判斷標準進行試驗操作，以大腸埃希菌ATCC25922作為藥敏質控菌株，測定69株雞白痢沙門菌對四環素的耐藥情況。

1.2.3 耐藥基因的檢測 根據文獻[2]，分別設計合成tet（A）、tet（B）、tet（C）、tet（M）和tet（X）引物，引物序列及擴增片段長度參見表1。參照《分子克隆實驗指南》，采用煮沸法提取細菌DNA模板作PCR反應。反應總體系（25 μL）：Premix Ex Taq 11.5 μL，雙蒸水9.5 μL，DNA模板3 μL，上、下游引物各0.5 μL。循環參數：熱蓋5 min，94℃預變性5 min；94℃變性40 s，55℃退火45 s；72℃延伸45 s；35個循環，72℃延伸10 min，16℃保溫，于-20℃保存備用。PCR擴增產物在1.2%瓊脂糖凝膠中進行電泳，在凝膠成像分析儀上觀察電泳結果。

1.2.4 產物的回收、克隆及測序 將PCR產物回收純化，與pMD18-T vector于16℃連接2 h后，轉化于感受態細胞DH5α，在氨芐抗性平板上篩選出可疑陽性克隆株送作序列測定。

表1 引物序列及相關信息

2 結果

2.1 受試菌株對四環素的耐藥性檢測結果 對耐藥性檢測結果進行統計分析，結果顯示69株雞白痢沙門菌對四環素的耐藥率為62.3%，MIC50值為128 μg/mL，MIC90值為256 μg/mL。具體見表2、表3。

表2 受試菌MIC試驗結果統計

表3 四環素抑菌濃度（μg/mL）結果統計

2.2 受試菌株耐藥基因檢測結果 經PCR和瓊脂糖凝膠電泳分析，69株雞白痢沙門菌僅擴增出tet（A）1種耐藥基因，檢出率為75.4%(52/69)，未能檢出耐藥基因tet（B）、tet（C）、tet（M）和tet（X）。在43株對四環素耐藥的雞白痢沙門菌中，有39株攜帶tetA基因，符合率為90.7%。BLAST比對測序結果表明，所擴增出的tetA基因與GenBank數據庫中目的基因序列的相似性大于98%。耐藥基因tetA PCR產物電泳結果見圖1。

3 討論

3.1 雞白痢沙門菌對四環素的耐藥性 各種抗生素的廣泛應用導致雞白痢沙門菌及其他細菌對抗菌藥物的耐藥問題已經十分嚴重[3]。雞白痢沙門菌的耐藥性研究已在國外得到了高度關注，國內的相關研究資料尚需要豐富。潘志明等[4]報道了20世紀80年代江蘇省雞白痢沙門菌對四環素類藥物的耐藥率上升，20世紀90年代對大部分藥物的耐藥率可達50%以上，有的甚至達100%。仇莉等對江蘇東臺區70株雞白痢沙門菌進行藥敏試驗，其中對四環素產生了較高的耐藥性，耐藥率為47.1%；徐君等[5]檢測了2008-2009年間從江蘇、鹽城、南通等地區分離的60株雞白痢沙門菌的耐藥性，結果顯示，分離株對四環素的耐藥率達63.3%；董洪燕等和嚴曉玲等[6，7]的檢測結果也顯示了雞白痢沙門菌對四環素耐藥的嚴重性，耐藥率分別為88%和100%。以上研究均表明，雞白痢沙門菌的耐藥問題已日益突出，對當前食品安全和公共衛生領域構成嚴重的威脅。本研究檢測69株雞白痢沙門菌對四環素的耐藥情況，結果顯示，有43株分離菌株產生了耐藥，耐藥率達62.7%，四環素的MIC50值為128 μg/mL，MIC90值均為256 μg/mL，表明珠三角地區的雞白痢沙門菌對四環素的耐藥情況比較嚴重，與現有研究報道結果相一致。

3.2 雞白痢沙門菌對四環素耐藥基因的攜帶情況研究報道表明，tet（A）基因主要位于結合性質?；蛘逿n1721等轉座子上，該基因在對四環素耐藥的沙門菌中廣泛分布，當tet基因成為這些可移動遺傳成分的一部分，如質粒和轉座子，它們將很容易從一個細菌轉移到另外一個[8]。本研究的結果表明，對四環素耐藥的雞白痢沙門菌中所攜帶的四環素耐藥基因僅有tet（A）基因，與其他研究結果一致。王曉泉等[9]研究認為，18株雞白痢沙門菌僅含有tetA基因，尚有研究稱通過調查tet基因在雞源沙門菌中的流行性證實，tet（A）基因是雞白痢沙門菌和雞傷寒沙門菌惟一的四環素耐藥基因。提示tet(A)基因在雞白痢沙門菌中分布非常廣泛，雞白痢沙門菌對四環素的耐藥機制以tet（A）基因介導的主動外排為主。

[1]涂玉蓉，陳建紅，任濤，等.基于等位基因特異性PCR原理建立雞白痢沙門氏菌PCR方法[J].中國畜牧獸醫，2011，38（5）:93-96.

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[5]徐君，仇莉，錢新民，等，江蘇部分地區雞白痢沙門菌的耐藥性分析[J].中國家禽，2010(11):57-58.

[6]董洪燕，李鑫，曹宇凡，等，雞白痢沙門菌分離株的耐藥性及磺胺類耐藥機制研究[J].中國家禽，2010（9）:29-33.

[7]嚴曉玲，邵紅.雞白痢沙門菌臨床分離株的耐藥性分析[J].黑龍江八一農墾大學學報，2012(2)：23-26.

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[9]王曉泉，王彥紅，吳雙，等.四環素耐藥基因在雞源沙門氏菌中的分布和傳播[J].中國家禽，2007（9）:10-12，18.