活性污泥中異養硝化-好氧反硝化菌的分離及其脫氮性能

曹 林，衣學文，2，董 濱，魯 超，黃 鑫，丁國際

（1.上海大學環境與化學工程學院，上海 200444；2.金山環境監測站，上海 201500；3.同濟大學環境科學與工程學院，上海 200092）

異養硝化－好氧反硝化技術是一種利用異養微生物在好氧條件下進行直接脫氮，與A/A/O技術相比具有以下特點［1］:(1)不需要分別進行硝化和反硝化，簡化了工藝；(2)不需要為反硝化投加額外碳源；(3)由于異養細菌可以利用有機碳源、異養硝化－好氧反硝化菌在去除氮污染物的同時還可以去除有機碳污染物。異養硝化－好氧反硝化技術由于這些特點日益受到關注。

Kshirsagar等［2］將從土壤中分離的 Paracoccus pantotrophus投入氧化溝后，與未投菌的對照系相比，硝化和反硝化率分別提高了10%和20%。Kulkarni等［3］采用Thiosphaera pantotropha處理300mg/L的硝基酚廢水，去除率達90%以上。Zhang等［4］從豬糞污水中分離出一株Pseudomonas stutzeri YZN－001，該菌株具有良好的異養硝化和好氧反硝化能力，并且在低溫下對銨的去除能力尤為顯著。Chen等［5］從豬場廢水中分離出一株 Rhodococcus sp.CPZ24，該菌株在25h內將85%的100mg/L氨氮轉化為13%硝氮、24%細胞內氮以及48%氣態的反硝化產物。異養硝化－好氧反硝化技術的應用性與能否得到高效的異養硝化－好氧反硝化菌有關，為此本研究重點進行高效異養硝化－好氧反硝化菌的篩選和硝化脫氮特性的研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 活性污泥

活性污泥樣品取自上海某城市污水處理廠二沉池回流污泥。

1.1.2 細菌培養基

細菌培養所用的BTB培養基［6］、異養硝化培養液［7］、牛肉膏蛋白胨培養基［8］，試劑均購自上海國藥(集團)化學試劑有限公司，分析純。

1.1.3 儀器和設備

試驗所用的主要儀器和設備:雙光束紫外可見分光光度計UV－4802型(上海尤尼克儀器有限公司)；分光光度計DR/800型(美國哈希公司)；高速冷凍離心機5804R型(上海飛鴿儀器有限公司)；低溫生化培養箱LRH－150型(上海一恒科學儀器有限公司)；氣浴恒溫振蕩器CHA－S型(江蘇金壇市江南儀器廠)；倒置生物顯微鏡37XB型(上海光學儀器五廠)；冷凍干燥機LGJ－12型(寧波新芝生物科技股份有限公司)；掃描電鏡JSM－6700F型(日本JEOL公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 好氧反硝化細菌分離、培養和純化

將活性污泥用無菌水稀釋后涂布到BTB平板培養基上后，于30℃下培養2 d。在平板上挑選出周圍顯藍色的菌落［6］，在牛肉膏蛋白胨平板培養基上劃線分離純化5次，最后將菌種接種到試管的牛肉膏蛋白胨固體斜面培養基上，于30℃下培養成菌落后，置于4℃冰箱中保存。

1.2.2 異養硝化－好氧反硝化菌的篩選

將斜面培養基中的菌種接種到異養硝化培養液中，于30℃下振蕩培養2 d，檢測到培養液中氨氮濃度明顯下降的菌種即為異養硝化－好氧反硝化菌［9］。

1.2.3 異養硝化－好氧反硝化菌的鑒定

將菌株用100μL水稀釋，沸水浴煮5min，進行菌落PCR。用于16S rRNA PCR反應的引物為1對通用引物，即正向引物為27f(5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’)和反向引物為1492r(5’GGTTACCTTGTTACGACTT 3’)。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。PCR體系建立(50μL):DNA模板10 pmol，正反引物(10μmol/L)各1μL，dNTP混合物(10mmol/L)1μL，10×Taq反應緩沖液5μL，Taq聚合酶(5μ/μL)0.25μL，加水至50μL。PCR反應條件:98℃預變性5mim；循環95℃、35 s，55 ℃ 、35 s，72 ℃、90 s，進行 35個循環，最后72℃延伸8min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析，進行16S rRNA測序，測序結果提交GenBank進行BLAST檢索。

1.2.4 異養硝化－好氧反硝化菌的硝化脫氮性能分析

菌懸液的制作:將異養硝化－好氧反硝化菌接種于牛肉膏蛋白胨培養基中于30℃下振蕩培養1 d，離心收集，并以無菌水清洗三次，最后用無菌水調節OD600至0.6～0.8，平板計數結果表明此時細菌在水中濃度約107CFU/mL。

硝化脫氮性能測試:將菌懸液以5%(體積比)的量接種至異養硝化培養液中，做3個平行樣，于30℃恒溫振蕩器中培養2 d，每隔12h取樣分析培養液中的水質。

1.2.5 水質分析

NH3－N、TN、－N、－N等水質指標的測定參照《水和廢水監測分析方法》(第四版)［10］中的標準方法，其中NH3－N采用納氏試劑光度法，TN采用過硫酸鉀氧化紫外分光光度法，－N采用紫外分光光度法，－N采用N－(1－萘基)－乙二胺光度法。

2 結果與討論

2.1 異養硝化-好氧反硝化菌的篩選

從BTB培養基中篩選出10株好氧反硝化菌，分別編號為CL1～CL10，保存在試管斜面培養基中。將試管斜面培養基中的菌種分別接種至異養硝化培養液中在溫度30℃的條件下進行培養，培養液中氨氮初始濃度為50mg/L，碳氮比(COD/NH3－N)為20，pH為7，48h 后各菌株對氨氮的去除率如圖1所示。10株好氧反硝化菌中，有3株菌株對氨氮的去除率較高，超過了60%，說明具有異養硝化能力，是異養硝化－好氧反硝化菌，這3株菌株分別為CL1、CL6和CL9，因此對這三株菌株作了進一步研究。

圖1 不同菌株對氨氮的去除率Fig.1 Effect of Different Strains on Removal Rate of Ammonia Nitrogen

2.2 異養硝化-好氧反硝化菌的鑒定

三株菌株的掃描電鏡(SEM)照片，如圖2～圖4所示。由圖可知CL1和CL9菌皆為長桿菌，而CL6菌為短桿菌。CL1、CL6和CL9菌的平均大小分別為0.5μm×1.4μm、0.5μm ×0.8μm 和0.5μm ×1.9μm。

圖2 CL1的掃描電鏡照片ig.2 SEM Analysis of Strain CL1

圖3 CL6的掃描電鏡照片ig.3 SEM Analysis of Strain CL6

圖4 CL9菌的掃描電鏡照片ig.4 SEM Analysis of Strain CL9

三株菌株經16S rRNA基因序列測定，通過BLAST檢索與GenBank中的核酸序列進行同源性比對，表明菌株CL1和CL9與枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis subsp.subtilis(模式菌株IAM 12118，GenBank授權號AB042061)有99%的相似性，菌株CL6與土地戈登氏菌Gordonia terrae(模式菌株NML88－1049，GenBank授權號DQ180334)同源性較高，為99%。

根據三株菌株的形態特征、生理生化特性和16S rRNA鑒定結果，確定CL6為G.terrae，而由于CL1和CL9在菌株形態上稍有不同，因此它們應同屬于B.subtilis的亞種或變種［11］。分別命名 CL1、CL6和CL9菌為B.subtilis CL1，G.terrae CL6和B.subtilis CL9，將其16S rRNA基因序列提交至GenBank得授權登錄號 JN862636、JN862637、JN8626388。

2.3 異養硝化-好氧反硝化菌的硝化脫氮特性

在以檸檬酸鈉為唯一碳源、硫酸銨為唯一氮源，初始氨氮濃度為50mg/L、碳氮比(COD/NH3－N)為20、培養液pH為7、溫度為30℃的條件下，以5%(體積比)的量接種B.subtilis CL1和B.subtilis CL9菌懸液，兩菌的生長情況較好，對水中的氨氮和總氮有較高的去除率；G.terrae CL6(以5%體積比的量接種菌懸液)在以乙酸鈉為唯一碳源、硫酸銨為唯一氮源、初始氨氮濃度為50mg/L、碳氮比(COD/NH3－N)為20、培養液pH為7、溫度為30℃的條件下，生長情況和對氨氮和總氮的去除效果均較好。三株異養硝化－好氧反硝化菌的硝化脫氮特性顯示在圖5～圖7中。

圖5 B.subtilis CL1的硝化脫氮特性Fig.5 Nitrification Denitrification Charactristics of B.subtilis CL1

圖6 B.subtilis CL9的硝化脫氮特性Fig.6 Nitrification Denitrification Charactristics of B.subtilis CL9

圖7 G.terrae CL6的硝化脫氮特性Fig.7 Nitrification Denitrification Charactristics of G.terrae CL6

由于B.subtilis CL1和 B.subtilis CL9同屬于B.subtilis的亞種或變種，兩菌的16S rRNA相似性為99%，因此它們的生長情況和硝化脫氮特性表現較一致。由圖5和圖6可知在試驗過程中，B.subtilis CL1和B.subtilis CL9的生長曲線(OD600)在前36h內呈直線上升，為對數生長期階段，隨后兩菌逐漸進入靜止期。培養液的氨氮濃度在前36h內直線下降，36h時 B.subtilis CL1和 B.subtilis CL9對氨氮的去除率分別為90%和86%，隨后氨氮濃度的下降趨勢趨于平緩，48h時兩菌對氨氮的去除率皆達到了99%?？偟獫舛鹊淖兓冀K呈直線下降，48h時B.subtilis CL1和B.subtilis CL9對總氮的去除率分別為98%和96%。在此過程中，系統內沒有檢測到亞硝酸鹽氮，但檢測出有硝酸鹽氮的累積；隨著時間的延長，硝酸鹽氮濃度先升高后降低，在24h時累積最大，約11mg/L，48h時降為零。以上說明兩菌在好氧條件下先將氨氮氧化為硝酸鹽氮，再使硝酸鹽氮還原為含氮氣體從水中脫除，兩菌的異養硝化作用優于好氧反硝化作用，因此在硝化和脫氮過程中有硝酸鹽氮的累計。

與B.subtilis CL1和 B.subtilis CL9不同，G.terrae CL6的生長趨勢隨時間的變化有3個明顯的階段:停滯期、對數期和衰亡期(如圖7)。菌株在接種后的12h進入對數生長期，24h生長速度最快，36h細菌細胞密度(用吸光度OD600來表示)達到最高，隨后進入衰亡期。由圖6可知，氨氮減少與細菌的生長有相反的趨勢，氨氮在12h時進入快速去除期，36h時氨氮的濃度由最初的54.6mg/L降至5.8mg/L，去除率為89%。隨后氨氮的降解速度變慢，最終在48h時得到全部去除。G.terrae CL6在異養硝化過程中，總氮的去除率與氨氮的去除率保持一致，系統內無亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮的累積，48h時總氮去除率達100%。

由以上三株菌株的硝化和脫氮特性可知，氨氮和總氮的快速去除期與細菌的對數生長期是一致的，這與Verstraete［12］報道的異養硝化－好氧反硝化作用普遍發生于老齡細胞中的結論不同，而與Su等［13］和張培玉等［14］的研究結果一致。目前的研究表明異養硝化－好氧反硝化作用與菌株體內的氨單加氧酶、羥胺氧化酶和周質硝酸還原酶等有密切關系［15］，但是不同菌株的氨單加氧酶、羥胺氧化酶和周質硝酸還原酶序列相似性不完全一樣［16］，因此就可能導致不同的異養硝化－好氧反硝化菌有不同的氨氮和總氮代謝機制。

比較三株異養硝化－好氧反硝化菌的硝化脫氮特性，B.subtilis CL1和B.subtilis CL9在脫氮過程中有硝酸鹽氮的累積，而G.terrae CL6在脫氮過程中卻沒有檢測出硝酸鹽氮，因此G.terrae CL6比其他兩菌具有更好的好氧反硝化能力，能將異養硝化過程中產生的硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮迅速還原為含氮氣體從水中脫除。

綜合以上結果，三株菌株都顯示出較強的異養硝化－好氧反硝化能力，在溫度為30℃、碳氮比為20、pH為7的條件下，48h之內就能將50mg/L的氨氮幾乎全部脫除，這比林燕等［17］所報道的Bacillus sp.LY效率高，但與張培玉等［14］報道的Pseudomonas sp.QY37和Joo等［18］所報道的Alcaligenes faecalis No.4相比還有一定的差距，因此三株菌株的硝化和脫氮能力還有待提高。不過，G.terrae CL6在異養硝化－好氧反硝化的過程中沒有硝酸鹽氮的累積，將有良好的應用前景。

3 結論

(1)從活性污泥中分離篩選出三株異養硝化－好氧反硝化菌，根據其形態特征、生理生化特性和16S rRNA鑒定結果，確定兩株為Bacillus subtilis，另一株為Gordonia terrae，因此分別命名這三株菌株為B.subtilis CL1，G.terrae CL6和 B.subtilis CL9。

(2)在以檸檬酸鈉為唯一碳源、硫酸銨為唯一氮源、初始氨氮濃度為50mg/L、碳氮比(COD/NH3－N)為20、異養硝化培養液pH為7、溫度為30℃的條件下，B.subtilis CL1和B.subtilis CL9在培養48h后對培養液中的氨氮去除率為99%，對總氮的去除率分別為98%和96%；在此期間系統內有硝酸鹽氮累積，在24h時累積量最大為11mg/L，隨后硝酸鹽氮濃度逐漸下降，48h時為零。

(3)在以乙酸鈉為唯一碳源、硫酸銨為唯一氮源、初始氨氮濃度為50mg/L、碳氮比(COD/NH3－N)為20、異養硝化培養液pH為7、溫度為30℃的條件下，G.terrae CL6在培養48h后對氨氮和總氮的去除率均達到100%，期間無亞硝酸鹽氮或硝酸鹽氮的累積。

［1］楊航，黃鈞，劉博.異養硝化－好氧反硝化菌 Paracoccus pantotrophus ATCC35512的研究進展［J］.應用與環境生物學報，2008，14(4):585－592.

［2］Kshirsagar M，Gupta A B，Gupta S K.Aerobic denitrification studies on activated sludge mixed with Thiosphaera pantotropha［J］.Environmental Technology，1995，16(1):35－43.

［3］Kulkarni P.M.Effect of shock and mixed loading on the performance of SND based sequencing batch reactors(SBR)degrading nitrophenols ［J］. WaterResearch， 2012， 46:2405－2414.

［4］Jibin Zhang， PengxiaWu， Bo Hao， etal. Heterotrophic nitrification and aerobic denitrification by the bacterium PseudomonasstutzeriYZN－001Heterotrophic nitrification and aerobicdenitrification by the bacterium ［J］. Bioresource Technology，2011，102:9866－9869.

［5］Peizhen Chen， JiLi， Qing X. Li， etal. Simultaneous heterotrophic nitrification and aerobic denitrification by bacterium Rhodococcus sp.CPZ24［J］.Bioresource Technology，2012，116:266－270.

［6］Matsuzaka E，Nomura N，Nakajima－Kambe T，et al.A simple screening procedure for heterotrophic nitrifying bacteria with oxygen－tolerant denitrification activity ［J］.Journal of Bioscience and Bioengineering，2003，95(4):409－411.

［7］Lin Y，He Y L，Kong H N，et al.Isolation and characterization of heterotrophic nitrifying bacteria in MBR ［J］. Journalof Environmental Sciences，2005，(4):589－592.

［8］周群英，王士芬.環境工程微生物學［M］.第三版.北京:高等教育出版社，2008.

［9］金敏，王景峰，孔慶鑫，等.好氧異養硝化菌 Acinetobacter sp.YY－5的分離鑒定及脫氮機理［J］.應用與環境生物學報，2009，15(5):692－697.

［10］國家環境保護總局水和廢水監測分析方法編委會.水和廢水監測分析方法［M］.第四版.北京:中國環境科學出版社，2002.

［11］Buchanan R E.中國科學院微生物研究所伯杰細菌鑒定手冊翻譯組，譯.伯杰細菌鑒定手冊［M］.第八版.北京:科學出版社，1984.

［12］Verstraete W.Heterotrophic nitrification in soils and aqueous media［J］.Biol，1975，4:541－558.

［13］Su J J，Yeh K S，Tseng P W.A strain of Pseudomonas sp.isolated from piggery wastewater treatment systems with heterotrophic nitrification capability in Taiwan ［J］.Current microbiology，2006，53(1):77－81.

［14］張培玉，曲洋，于德爽，等.菌株qy37的異養硝化/好氧反硝化機制比較及氨氮加速降解特性研究［J］.環境科學，2010，31(8):1819－1826.

［15］Butler C S，Richardson D J.The emerging molecular structure of the nitrogen cycle:an introduction to the proceedings of the 10th annual N－cycle meeting ［J］.Biochemical Society Transactions，2005，33(1):113.

［16］席亞萍.異養硝化菌的脫氮活性及功能基因的研究［D］.上海:華東師范大學，2010.

［17］林燕，孔海南，何義亮，等.異養硝化細菌的分離及其硝化特性實驗研究［J］.環境科學，2006，27(2):324－328.

［18］Joo H，Hirai M，Shoda M.Characteristics of ammonium removal by heterotrophic nitrification－aerobic denitrification by Alcaligenes faecalis No.4［J］.Journal of Bioscience and Bioengineering，2005，100(2):184－191.