傅學才
(湖南省婁底市婁星區畜牧水產技術服務中心,湖南婁底417000)
豬鏈球菌的分離、16SrRNA鑒定及藥敏實驗
傅學才
(湖南省婁底市婁星區畜牧水產技術服務中心,湖南婁底417000)
從湖南婁底某豬場病豬組織中分離出6株細菌,通過培養特性、細菌染色鏡檢、16sRNA基因擴增及序列BLAST分析等系統鑒定,確定為豬鏈球菌。并對分離菌與GenBank中收錄的17株豬鏈球菌的16SrRNA基因序列的進行同源性比對,結果顯示,6株分離菌的16SrRNA基因序列與收錄菌株同源性為99%以上。藥物敏感試驗表明,分離細菌對頭孢類、β內酰胺類藥物高度敏感、對磺胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類、四環素類藥物產生耐藥。而6株分離細菌對氯霉素類藥物的敏感,但敏感性有差異。
豬鏈球菌,16SrRNA基因,藥物敏感實驗
豬鏈球菌病是一種人畜共患的急性、熱性傳染病,可致豬腦膜炎、關節炎、肺炎、心內膜炎、多發性漿膜炎。臨床表現為急性出血性敗血癥、哺乳仔豬下痢和孕豬流產等,可致生豬死亡,危害較嚴重。據報道血清型眾多,目前有35個血清型,而且變異頻繁。筆者在湖南婁底某豬場剖檢了疑是豬鏈球菌病的生豬2頭,從采集的組織樣中分離出6株細菌,通過細菌形態學、16SrRNA等系統鑒定,確定為豬鏈球菌?,F將結果報告如下。
湖南省婁底的兩個豬場采集的三元仔豬2頭和6份病料。鮮血瓊脂、巧克力瓊脂購自江門市凱林貿易有限公司。即用型PCR Mix試劑盒購自北京天恩澤基因科技有限公司,藥敏紙片分別購自上杭州微生物試劑公司
將采集的組織病料在超凈工作臺內接種于鮮血瓊脂培養基、巧克力瓊脂培養基,于37℃培養24 h,觀察細菌菌落形態特征,挑取疑是豬鏈球菌的菌落進行純培養。
挑取疑是豬鏈球菌純培養菌落涂片,進行革蘭氏染色、顯微鏡下鏡檢,觀察細菌形態特征。
1.4.1 細菌基因組DNA的提取
用煮沸方法提取細菌DNA模板,離心過夜培養菌液,加入150μLTE緩沖液混均后,沸水中煮沸10min,冰浴后離心取上清夜做PCR反應的模板。
1.4.2 對分離菌進行PCR鑒定
按Makino S的方法設計豬鏈球菌16SrRNA(M23728)PCR引物。上游引物P1:
5’-ACGCGTAGGTAACCTGCCTC-3’,下游引物 P2:5’-GCCATTGTAGCACGTGTGT-3’。 擴增片段理論長度為1130bp。反應體系(50μL):10×Taq bufer 5.0μL,dNTPs(2 mmol/L)5.0μL,MgCl2(20mmol/L)3.0μL,上下游引物(20 p mol/μL)各 2.0μL,Taq DNA聚合酶(2 U/μL)1.5μL,模板2.5μL,滅菌雙蒸水29.0μL。反應程序:94℃預變性 2 min;94℃ 1min,56℃ 2min,72℃ 2 min,30 個循環;72℃延伸7 min。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物,在凝膠成像系統下觀察結果。
1.4.3 測序
PCR產物送上海生工測序,測序結果進行BLAST比對。
選擇鑒定豬鏈球菌的菌株培養液涂布接種于鮮血瓊脂平板,在無菌操作條件先將將藥敏試紙片平貼于培養基表面,37℃培養箱培養24 h,測量其抑菌圈直徑。
2.1.1 從采集的病豬組織樣品中分離到13株細菌,其中6株出現α溶血現象。
2.1.2 6株出現α溶血現象細菌染色鏡檢為呈鏈狀排列的革蘭氏陽性球菌(見圖1)。
分離菌株的PCR擴增產物為1130 bp大小的片段,與預期目的片段相符(見圖2)。
對分離菌采用16S rRNA的引物對其可變區基因進行克隆、測序和同源性比對,并用BLAST軟件分析其同源性。結果表明,此6株菌株通過同源性比對,與GenBank數據庫中收錄的17株鏈球菌的16SrRNA基因序列同源性均大于99%,16SrRNA基因進行PCR擴增(圖3)。
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分離菌株對頭孢頭孢噻肟、先鋒霉素、青霉素高度敏感,對復方新諾明、鏈霉素、強力霉素、阿奇霉素耐藥,對氨芐西林、恩諾沙星、氟苯尼考的敏感性6株菌有差異。結果見表1。
采取欄舍徹底消毒,發病豬隔離。青霉素或頭孢喹肟配合治療,治療期間飼料中添加一定量的復合多維和黃芪多糖,有效地控制了疫情,沒有發生人的感染病例。
實驗結果表明,在分離菌落的基礎上,采用細菌16SrRNA基因可初步鑒定豬鏈球菌,而且可以撥開鏈球菌多樣性的干擾,準確度高。但分型和致病性還要進行血清學分型試驗和毒力測定,進一步用小白鼠實驗和動物回歸實驗佐證。
對6株分離菌進行藥敏試驗,結果表明該分離菌對頭孢類和β內酰胺類高度敏感,與相關文獻報道豬鏈球菌藥敏結果不一致,這可能與不同豬場藥物的耐藥性有關,因此,對于細菌病的治療最好在藥敏試驗基礎上合理用藥。預防和保健時盡量少用和避免長期使用同一種藥物?!?/p>
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S858.28
A
1006-4907(2014)03-0021-02
10.3969/j.issn.1006-4907.2014.03.010
2014-05-10