一種基于二代測序技術的無創產前診斷方法

姚 琳

(上海交通大學生物工程專業 工程碩士班級Z1208021，上海200240)

1 傳統檢測方法回顧

以往對染色體非整倍體疾病的產前檢測大多采用血清學篩查加胎兒染色體核型分析診斷的方法，前者的假陽性率較高，約有5%－10%的孕婦將被篩查為高風險，這些數量眾多孕婦不得不接受后者的診斷，而胎兒染色體核型分析又需要進行羊水穿刺等，這類侵入式診斷方式意味著約1% 的流產率［1］，于是非侵入性的產前檢測方式成為廣大孕婦和醫療工作者共同的追求。同時，血清學篩查方法極高的假陰性率又使得為數眾多的患兒出生，給病人、家屬和社會帶來負擔，于是尋求一種準確率較高的篩查方法刻不容緩。

傳統檢測方法的準確率如圖1 顯示。

圖1 唐氏綜合征傳統篩查方法的準確率

2 無創產前檢測技術方法原理

無創產前檢測( Noninvasive prenatal testing，NIPT) 是以孕婦外周血(5 mL) 作為檢測樣本，通過不加區分的對其中的總游離DNA 進行大規模平行測序，結合數學模型和數據分析，對胎兒染色體非整倍性疾病進行檢測。該方法在唐氏綜合征、13－三體綜合征和18－三體綜合征的產前檢測方面，方法成熟，數據可靠。該方法可以在胎盤循環建立后的整個孕期進行檢測［2］，本著早發現的原則，其最佳檢測時間為孕早、中期，如在孕晚期通過超聲等手段發現可疑病例，仍可使用該方法進行檢測。

為了更好地解釋其原理及數據分析依據，以21號染色體為例作如下假設:

如圖2 所示，假設每毫升母體外周血中的染色體中有1 000 份21 號染色體基因組當量，母源性的染色體占900 份，胎源性的染色體占100 份。對于懷有正常胎兒的孕婦，胎源性的100 份中有200 份的單鏈片段可以通過比對定位于21 號染色體上，母源性的900 份中有1 800 份的單鏈片段可以通過比對定位于21 號染色體上，通過計數，共獲得2 000份21 號染色體單鏈片段。而對于懷有唐氏綜合征胎兒的孕婦，由于其來自胎兒的21 號染色體多出一條，則胎兒的100 份基因組當量中含有300 份的單鏈片段可以通過比對定位于21 號染色體上，母親的900 份基因組當量中含有1 800 份的單鏈片段可以通過比對定位于21 號染色體上，兩者相加，2 100 份的單鏈片段可以通過比對定位于21 號染色體上。即使考慮染色體片段化程度不同的偶發因素，在測序通量足夠大的情況下，可以得到比較確定的結果，即懷有21－三體胎兒的單鏈片段數要大于懷有正常胎兒的單鏈片段數，從而對疾病進行檢測。

圖2 數據比較:21－三體胎兒與正常胎兒

3 無創產前診斷的具體操作

具體操作方法為，首先從離心孕婦外周血后獲得的血漿中抽提DNA，收集總DNA 中符合一定長度的DNA，通常為100－200 bp，因為這個長度的總游離DNA 中，胎兒游離DNA 的含量高，有利于后續檢測。然后使用T4 DNA 聚合酶( T4 DNA Polymerase)、克列諾片段( Klenow Fragment)、T4 多聚核苷酸激酶(T4 PNK)補平片段末端。在片段3’端加堿基A，根據堿基互補配對的原則，使其與帶有T 堿基的接頭(Adaptor)連接，該接頭上還連有大規模平行測序所需的索引序列。使用PCR 對兩端帶有接頭的DNA 片段進行擴增并使用磁珠法純化PCR 產物。對得到的該長度的DNA 片段進行平行隨機測序，通過對每條DNA 片段檢測其前25個或36個堿基(由廠家提供的不同讀長的測序試劑盒決定)，然后通過對這些確定了一段序列的特征DNA 片段與參考序列的比對，將這些片斷歸類到每條染色體。計算歸類到每條染色體的片段數量占總片段數量的百分比。如果胎兒是21－三體，則21 號染色體的特征片段的量將有過度表達，也就是說歸屬于21 號染色體的特征DNA 片斷的比例將有所升高，通過對這種微小的升高進行區分，根據統計學經驗設定一個閾值(Z Score)，篩選出超過該閾值的樣本，從而檢測出患有相應染色體非整倍體疾病的胎兒。

4 無創產前診斷與傳統診斷方法的特點對比

傳統的唐氏篩查采用在孕早期超聲檢測胎兒NT 值聯合母體血清中的PAPP－A［3］，在孕中期檢查母體血清中的AFP、hCG、uE3( +Inhibin－A)，準確率(即敏感性)在64%－96%［4］，該方法一方面只能達到篩查出部分病例(即64%－96%) 的目的，另一方面，高于5%的孕婦會得到高危結果［5］( 即特異性約為95%)，按照染色體非整倍體疾病的發病率推算，這些得到高危結果的孕婦中約98%其實懷有健康胎兒，然而在得到高危結果后，孕婦需要通過有創的羊水穿刺或臍帶穿刺等進行染色體核型分析來進行確診(該技術的準確率約為100%)，從而決定胎兒的去留，而穿刺會有1%左右的流產率，從而成為很多孕婦顧忌之處。經過多年的研究，利用第二代測序技術檢測母體外周血中的胎兒游離DNA 可以克服上述缺陷。于是當高通量深度測序技術走向成熟后該技術也得以從理論走向了臨床現實［6］。

5 無創產前診斷技術的局限

由于無創產前檢測技術可以對每條染色所占總染色體的比例進行精確定量，從而彌補了血清學篩查方法不能檢測13－三體染色體數目異常的不足，并且該方法還能夠對大部分性染色體的非整倍體情況進行檢測。

盡管目前大多數相關機構只是對13、18 和21號染色體的檢測情況出具報告［7］，但就其原理和數據分析的過程可以認為，理論上該技術對任何一條染色體的常規非整倍體檢測都具有同樣的高敏感性和特異性，只是因為目前所用的數學模型尚缺乏臨床數據的支持和檢驗。

另外，目前該技術的難點還集中在三個方面:雙胎和多胎妊娠的檢測;性染色體非整倍體的檢測;嵌合型、平衡異位型染色體非整倍體以及染色體微重復和微缺失的檢測。對于雙胎及多胎妊娠，以雙胎妊娠為例，研究發現，其總DNA 中cffDNA 的含量大于相同孕周單胎妊娠的cffDNA 含量，但同時又小于其二倍，所以，該技術能夠檢出雙胎及多胎妊娠胎兒染色體非整倍體是否存在，但無法具體到個體［8］，盡管如此，該方法依舊為決定后續是否需要進行胎兒染色體核型分析提供了一定的依據［9］。對于性染色非整倍體的檢測，由于對母體和胎兒的游離DNA 不加區分隨機測序，故對于XXY 三體型、XYY三體型的性染色體非整倍體必須結合孕周考慮，并增加測序的覆蓋深度( coverage) 進行檢測，目前尚存在一定難度，對于X 單體型、XXX 三體型的性染色體非整倍體，理論上具有和檢測其他染色體同樣的敏感性和特異性。對于嵌合型、平衡異位型染色體非整倍體以及染色體微重復和微缺失的檢測，目前還不具備有效的方法和數據，這是該技術的局限性。

表1 篩查指標與存在問題

6 總結

經過多年的研究、實踐和改進，這項基于母體外周血中游離胎兒DNA 片段測量的無創產前檢測方法，在與高通量測序技術的結合下，逐漸走向成熟，并應用于臨床。與傳統的通過超聲技術以及檢測血清中各種激素的篩查技術相比，該技術具有經過多方論證的，顯著提高的敏感性和特異性［11］。而與作為產前診斷金標準的染色體核型分析技術相比，該技術又以取樣的無創性見長。隨著二代測序成本的不斷下降，該技術有望越來越廣泛地應用于臨床，目前推薦的流程是，首先通過該技術對幾乎全部孕婦進行篩查［11］，其優越的敏感性可以篩出高于99%的病例，與此同時，其出色的特異性又使得只有不足1%的孕婦需要接受下一步的有創診斷［12］，極大地提高非整倍體疾病的檢出率的同時降低了為診斷而造成的損失，具有杰出的社會價值。

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