端粒酶在整倍體與非整倍體細胞中的表達差異

胡騰惠 徐興祥

端粒是位于真核生物染色體末端的線性結構，具有抑制染色體末端進行重組及融合的功能，從而維持染色體的穩定性，端粒在細胞復制的過程中會不斷縮短，而端粒酶能夠維持端粒長度，從而促使細胞不斷進行復制[1]。研究表明，超過90%的惡性腫瘤具有端粒酶活性，而在正常細胞與組織中，則只能在淋巴細胞、造血細胞、生殖細胞等具有增殖潛能的細胞中檢測到端粒酶活性[2-4]。這就充分表明端粒酶可以作為一種腫瘤分子標志物來進行廣泛應用。非整倍體是指個別染色體減少或增加一條或幾條而導致染色體數目非整倍數，所以稱為非整倍體，是細胞分裂時染色體分離、染色體丟失、染色體易位異常的結果。非整倍體嚴重威脅人類的健康：某些先天性畸形綜合征、自發性流產、死胎形成的主要原因就同非整倍體相關，90%的實體瘤和50%的血液腫瘤也是非整倍體所致[5]。研究發現，端粒酶及非整倍體在腫瘤的發生發展中起重要作用，但端粒酶在整倍體與非整倍體細胞中的表達是否具有差異，端粒酶抑制劑疊氮脫氧胸苷(azidothymidine, AZT)對整倍體和非整倍體細胞端粒酶hTERT基因的表達及活性有何影響，目前尚不清楚，本研究擬對這些問題進行探討。

材料和方法

一、實驗材料

人HCT116細胞來源于蘇北醫院實驗中心，胎牛血清購于杭州四季青公司，AZT購于TCI公司，鹽酸強力霉素及吉姆薩染液購于索萊寶公司，nocodazole及Eukitt? 快速硬化封片劑購于sigma公司，MG132購于selleckchem公司，端粒酶活性試劑盒購于Roche公司，MAD2L1購于R&D Systems公司。

二、實驗方法

取人HCT 116細胞培養于含10%滅活胎牛血清、100 U/ml青鏈霉素DMEM 培養基中，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養。取處于對數生長期的HCT116細胞加入1/1 000的0.2 mg/ml 鹽酸強力霉素(doxycycline)，作用16 h后，撤掉鹽酸強力霉素，設為非整倍體組，并設立不加鹽酸強力霉素的HCT116細胞作為對照組，稱為整倍體組，撤藥當天為第1天，在撤藥后第11天，采用0、100、250 μmol/L的AZT處理兩組細胞72 h，設立空白對照組和AZT處理組。

1. 檢測指標： 在鹽酸強力霉素撤掉后第6、8、11天檢測整倍體組和非整倍體組細胞hTERT基因及端粒酶活性。在撤藥后第11天對整倍體組和非整倍體組細胞進行染色體滴定，取撤藥后第3天、第6天、第11天的細胞，檢測MAD2L1蛋白表達，檢測AZT處理組hTERT mRNA基因及端粒酶活性表達。

2. hTERT mRNA基因表達： 在撤藥后第6、8、11天采用RT-PCR檢測整倍體組和非整倍體細胞中hTERT mRNA基因表達差異，RT-PCR檢測空白對照組及其AZT處理組hTERT mRNA基因的表達hTERT正向引物：5′-AAGTTCCTGCACTGGCTGATG-3′，反向引物：5′-GCTTTGCAACTTGCTCCAGAC-3′。使用GAPDH作為內參。按照RNA提取步驟提取總RNA，采用酶標儀進行定量，逆轉錄反應采用thermo逆轉錄試劑盒，逆轉錄完畢后，采用vazyme公司的SYBR Green熒光定量試劑，進行熒光定量擴增。設置反應體系為95.0 ℃ 5 min，95.0 ℃ 10 s和60 ℃ 30 s共40個循環，95.0 ℃ 15 s， 60 ℃ 1 min，95.0 ℃ 15 s終止反應。

3. 端粒酶活性檢測： 在撤藥后第6、8、11天采用端粒酶活性試劑盒(TRAP-PCR-ELISA)對整倍體組和非整倍體組細胞端粒酶活性進行檢測，采用0、100、250 μmol/L的AZT處理兩組細胞72 h后，采用TRAP-PCR-ELISA檢測端粒酶活性的變化。收集待測細胞(2.5×103個)，制備端粒酶提取液，并進行PCR擴增。PCR條件：引物延伸 25 ℃ 15 min，端粒酶滅活 94 ℃ 5 min，擴增共30個循環：變性 94 ℃ 30 s，退火 50 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 90 s。72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存 PCR 產物。取擴增產物2.5 μl，進行ELISA反應。從酶標儀上讀取其在 450 nm 處的 OD 值，以690 nm處作為參考波長。端粒酶活性(RTA)計算公式為RTA=(AS-ASO)/AS.IS/[(ATS8-ATS8.0)/ATS8.IS]×100%，ΔA=AS-ASO，若ΔA大于兩倍的ASO則判定為端粒酶陽性；AS：樣品吸光度；ASO：熱處理后樣品吸光度；AS.IS︰IS樣品吸光度；ATS8：對照模板吸光度；ATS8.0：裂解液吸光度；ATS8.IS：對照模板的IS吸光度；由試劑盒提供陽性對照(為含有端粒重復序列的DNA片段)，陰性對照為將端粒酶提取物在85 ℃環境中處理10 min。

4. 染色體滴定： 取撤藥后生長至第11天的整倍體組和非整倍體組細胞加入80 ng/ml的有絲分裂抑制劑nocodazole和10 μmol/L的蛋白酶抑制劑MG132，在37 ℃孵箱中孵育6 h后，按照染色體滴定的步驟進行處理，然后滴于玻片上，待玻片晾干后使用吉姆薩染液進行染色，待晾干后采用Eukitt? 快速硬化封片劑進行封片，封片后在100×的油鏡下進行觀察計數，選取150個細胞進行拍照并對其染色體數目進行計數。將染色體數目為45條或46條定義為整倍體(根據ATCC細胞庫中關于HCT116細胞染色體核型的描述)，將染色體數目不是45或46條的細胞定義為非整倍體。

5. MAD2L1蛋白表達測定： Western blot 檢測兩組細胞撤藥后第3天、第6天、第11天MAD2L1蛋白表達變化。在撤藥后第3天、第6天、第11天分別收集整倍體組和非整倍體細胞，采用裂解液裂解細胞后獲得總蛋白。采用bio-rad法于575 nm處測定總蛋白濃度。然后，配制12%的SDS-PAGE分離蛋白樣品，上樣量60 μg，采用PVDF膜進行轉膜，恒壓2 h，5%的脫脂奶粉封閉1.5 h，一抗MAD2L1(1︰200稀釋)4 ℃封閉過夜。TBST洗滌3次后，室溫孵育二抗(1︰2 000稀釋)1 h，采用ECL化學發光劑進行顯色，采用凝膠成像系統進行顯影并拍照。目的蛋白的灰度值與內參α-Tublin灰度值的比值代表樣品中目的蛋白的相對含量。

三、統計學方法

所有數據采用SPSS18.0進行統計學分析，兩樣本均數比較采用t檢驗，兩獨立樣本率比較采用χ2檢驗，組內比較及組間比較采用雙因素方差分析，P<0.05為具有統計學差異。

結 果

一、染色體滴定

整倍體組中的150個細胞中，有10個是非整倍體，其整倍體率為93.3%，在非整倍體組的150個細胞中，共有117個細胞為非整倍體，非整倍體率為78%，見表1。

表1 整倍體組和非整倍體組細胞第11天染色體滴定結果比較

二、MAD2L1蛋白表達

在加入鹽酸強力霉素第3天后非整倍體組MAD2L1蛋白表達明顯下降，兩組比較具有統計學差異(P<0.05)。第6天時，MAD2L1逐漸恢復，第11天時，MAD2L1完全恢復正常，見圖1。

三、 撤藥后第6、8、11天hTERT mRNA基因表達及端粒酶活性

整倍體組和非整倍體組細胞在第6、8、11天hTERT mRNA基因的表達量分別為(1︰1.19±0.05、1︰1.21±0.02、1︰1.46±0.04)。非整倍體hTERT mRNA基因表達明顯高于整倍體，兩組細胞在第6、8、11天比較具有統計學差異(P<0.05)。整倍體組和非整倍體組細胞在第6、8、11天端粒酶活性分別為(2.87±0.01︰3.14±0.10、2.89±0.01︰3.25±0.03、2.79±0.03︰4.26±0.15)，非整倍體組細胞的端粒酶活性明顯高于整倍體，兩組細胞在第6、8、11天比較具有統計學差異(P<0.05)，見圖2。

圖1 加入鹽酸強力霉素后不同時間MAD2L1蛋白的表達變化

圖2 hTERT基因表達及端粒酶活性；注：A：整倍體組和非整倍體組細胞hTERT基因表達；B：整倍體組和非整倍體組細胞第11天端粒酶活性比較

四、AZT處理后hTERT mRNA基因表達及端粒酶活性

采用100、250 μmol/L的AZT作用整倍體和非整倍體細胞后，兩組細胞hTERT mRNA基因表達及端粒酶活性均出現不同程度的下降。與空白對照組相比，整倍體組hTERT mRNA基因表達在250 μmol/L處具有統計學差異(P<0.05)；端粒酶活性表達在100、250 μmol/L處具有統計學差異(P<0.05)。與空白對照組相比，非整倍體組hTERT mRNA基因表達及端粒酶活性在100、250 μmol/L處均具有統計學差異(P<0.05)。非整倍體組hTERT mRNA基因及端粒酶活性下降程度較整倍體組更明顯，整倍體組細胞在100、250 μmol/L處的hTERT mRNA基因下降率分別為5%、32%，端粒酶活性下降率為14.69%、25.40%；非整倍體組細胞在100、250 μmol/L處的hTERT mRNA基因下降率分別為38.46%、51.28%，端粒酶活性下降率為17.00%、54.27%，兩組細胞hTERT mRNA基因下降率在100、250 μmol/L處具有統計學差異(P<0.05)。兩組細胞端粒酶活性下降率在250 μmol/L處具有統計學差異(P<0.05)。見圖3。

圖3 hTERT基因表達及端粒酶活性；注：A：不同濃度AZT作用后hTERT基因表達情況；B：不同濃度AZT作用下端粒酶活性表達情況

討 論

非整倍體與腫瘤形成之間的關系一直以來備受關注，一些研究者認為非整倍體只是腫瘤形成過程中的一個產物，另外一些研究者認為非整倍體可以促進腫瘤形成。Duesberg等[6]提出的非整倍體假說認為，非整倍體可以促進腫瘤形成，他認為致癌物使細胞形成非整倍染色體，非整倍體導致有絲分裂相關基因異常表達，產生異常數目的中心粒及異常比例的紡錘體。不均衡的紡錘體可引起有絲分裂過程中染色體的隨機獲得或丟失，非整倍染色體隨機分配到子代細胞中，經過不斷的惡性循環，非整倍體催化自身細胞核型的不斷變化及進化，最終產生腫瘤細胞核型。大量研究發現非整倍體可以促進腫瘤形成，具有3條8號染色體會促進血液方面的腫瘤發生，25%的慢性粒細胞白血病及10%～15%的急性粒細胞白血病以及5%的急性淋巴細胞白血病患者都會出現3條8號染色體[7-9]。

研究表明一系列細胞壓力因子可以導致非整倍體的形成[10-11]，Meena等[3]通過采用慢病毒敲除GJB3、RXFP1(LGR7)、OSBPL、STARD9等基因獲得非整倍體，這些基因與腫瘤形成及整倍體形成的相關通路有關[12-16]。Li等[17]通過運用siRNA敲低MAD2L1獲得非整倍體，MAD2L1(MAD2)是紡錘體組裝檢查位點(SAC)的成分，SAC具有促使減數分裂過程中同源染色體或有絲分裂中姐妹染色單體間張力的形成[18]。如果SAC在有絲分裂過程中出現異常，則會導致染色體的錯誤分離，形成非整倍體。既往研究中尚未有人采用鹽酸強力霉素誘導非整倍體，據相關報道表明，鹽酸強力霉素可能具有誘導非整倍體的作用，本研究就這一問題進行嘗試，證實鹽酸強力霉素可以誘導非整倍體。我們就鹽酸強力霉素誘導非整倍體的機制進行研究發現，在撤藥后第3天，非整倍體細胞MAD2L1表達完全消失，表明鹽酸強力霉素能夠破壞SAC的成分MAD2L1，導致染色體的錯誤分離，繼而形成非整倍體，而隨著撤藥時間的增加，細胞MAD2L1逐漸恢復正常，表明不健康的非整倍體細胞大量死亡，而存活下來的非整倍體則可以繼續生長及增殖。與既往通過shRNA敲除相關基因或采用siRNA敲低MAD2等方法相比，采用藥物誘導非整倍體的方法操作簡便，價格便宜，為之后非整倍體的獲得提供了一個簡單易行的方法。

端粒酶由hTERT、端粒酶RNA組分、端粒酶相關蛋白組成，是一種核糖蛋白復合物，能以自身RNA為模板，合成端粒重復序列，將端粒DNA送至真核細胞染色體末端，使端粒延長。hTERT在端粒酶的激活過程中起關鍵作用，端粒酶活性的表達與其密切相關[19]。研究表明，部分腫瘤細胞由于端粒酶的作用，能無限增殖，從而成為永生化細胞。Zhang等[20]通過在羊胚胎成纖維細胞中導入hTERT基因，可以使羊胚胎成纖維細胞獲得無限增殖，從而成為永生化細胞。Meena等[3]研究發現，端粒酶可以拯救非整倍體誘導的端粒DNA的損傷、p53的激活、細胞早衰和耗竭。而關于整倍體與非整倍體之間端粒酶活性及hTERT基因表達的差異及作用，尚未有人進行相關研究，本研究發現非整倍體的端粒酶活性及hTERT基因表達明顯高于整倍體。本研究分別在第6、8、11天檢測hTERT基因及端粒酶活性，發現非整倍體hTERT基因及端粒酶活性表達逐漸升高，表明非整倍體的形成是一個不斷變化及進化的過程，在撤藥初期，不健康的非整倍體大量死亡，一部分非整倍體逃脫P53介導的凋亡作用，催化自身功能的不斷進化，某些細胞產生促進腫瘤形成的核型，從而發揮促腫瘤形成作用。

AZT是應用最廣的一種端粒酶抑制劑，能阻斷端粒復制模板與單核苷酸之間的結合，使腫瘤細胞維持端粒長度的機制遭到破壞，從而導致端粒隨著自身染色體復制而逐漸縮短，最終促進腫瘤細胞發生衰老凋亡[21-26]。研究表明，AZT可以對多種腫瘤細胞的端粒酶活性產生抑制作用，干擾細胞的正常生長及增殖[27-30]。本研究兩組細胞加入AZT后，hTERT基因表達及端粒酶活性均出現不同程度下降，表明AZT可以下調hTERT基因表達及端粒酶活性，非整倍體組細胞下降程度較整倍體明顯，表明非整倍體對AZT更敏感。

綜上所述，鹽酸強力霉素可以通過破壞紡錘體組裝檢查位點(SAC)的成分MAD2L1來誘導非整倍體形成，非整倍體細胞的端粒酶活性及hTERT基因表達高于整倍體，加入AZT后，整倍體細胞和非整倍體細胞hTERT基因表達及端粒酶活性均出現不同程度下降，非整倍體下降程度較整倍體明顯，非整倍體對AZT更敏感。而關于AZT對整倍體及非整倍體細胞功能的影響及其機制尚有待進一步研究。

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