糖尿病腎病患者血漿動態蛋白質組學研究

王衍慧，傅明捷，黃玉宇，李 靜

(廣州市第一人民醫院，廣州510180)

隨著人們生活水平提高、生活方式改變及社會老齡化問題日益嚴重，糖尿病(DM)發病率逐年上升，目前我國約有9 240萬DM患者，已成為全球DM第一大國［1］。糖尿病腎病(DN)作為DM常見的微血管并發癥，是終末期腎病最常見的原因［2］，也是DM的重要致死、致殘原因。本研究采用動態血漿蛋白質組學的研究方法，探討了DN與健康人群血漿差異蛋白表達，旨在為篩選DN血漿蛋白標志物提供理論和實踐依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2012年10月～2013年10月住院的DN患者4例，均符合王海燕主編的《腎臟病學》(3版)中的診斷標準及1999年WHO糖尿病診斷標準［3］。男2例、女2例，年齡56～62歲。選擇同期來自體檢中心的健康查體人群4例作為健康對照，男2例、女2例，年齡55～63歲。納入標準:符合診斷標準者;年齡18～80歲;血肌酐≤140 μmol/L;知情同意者。排除標準:妊娠、哺乳期婦女;血肌酐＞140 μmol/L;合并原發性心血管、肝臟、神經系統、血液系統疾病;合并嚴重感染等并發癥者。

1.2 方法

1.2.1 血清采集及處理 清晨空腹抽取兩組靜脈血10 mL，速凍存于液氮中，置于-70℃保存，備雙向電泳及質譜分析用。

1.2.2 雙向電泳及質譜分析

1.2.2.1 組織總蛋白抽提及蛋白質測定 將血清以12 000 r/min，4℃離心30 min后，吸取上清入EP管，用50 mmol/L氫氧化鈉調節pH值至8.5，取5 μL用于蛋白質濃度測定，其余上清置于-70℃保存備用。采用2D Quant Kit蛋白質定量試劑盒測定總蛋白濃度，其操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行，繪制標準曲線，計算直線回歸方程。

1.2.2.2 蛋白質熒光染料標記 每組蛋白質均取25 μg等量混合作為內標，50 μg內標蛋白用 400 pmol Cy2進行標記，分別以50 μg蛋白每400 pmol Cy3和400 pmol Cy5標記，冰上避光放置30 min，再加1 μL亮氨酸(10 mmol/L)中止反應10 min。

1.2.2.3 熒光差異雙向凝膠電泳(2D-DIGE)和圖像掃描 50 μg Cy2、Cy3和Cy5標記的樣品進行混合，加等體積的2×樣品緩沖液(8 mol/L尿素，2 mol/L 硫脲，4%CHAPS，2%Bio-lyte pH 4～7，130 mmol/L DTT)，再加適量水化液(8 mol/L尿素，4%CHAPS，1%Bio-lyte pH 4～7，13 mmol/L DTT)補至總體積450 μL，上樣，30 V水化13 h，然后經過100 V 0.5 h、500 V 0.5 h、1 000 V 1 h、5 000 V 1 h，最后穩定在8 000 V下進行等電聚焦8.5 h。電泳后取出IPG膠條先后置入平衡A液(50 mmol/L Tris-HCl pH 8.8，6 mmol/L 尿素，30% 甘油，1%SDS，0.2%DTT，痕量溴酚藍)和平衡B液(50 mmol/L Tris-HCl pH 8.8，6 mmol/L 尿素，30% 甘油，1%SDS，3% 碘乙酰胺，痕量溴酚藍)中各平衡15 min。平衡后的膠條移至濃度12.5%PAGE分離膠上端用0.5%瓊脂糖封膠，2.5 W電泳30 min，然后以11 W恒功率電泳，直至溴酚藍指示線到達凝膠底邊處停止電泳。整個過程均避光操作。雙向電泳后，取出膠條擦洗干凈，輕置Typhoon掃描儀，以Cy2(488 nm激發激光和520BP40發射過濾器)、Cy3(532 nm激發激光和580BP30發射過濾器)和Cy5(633 nm激發激光和670BP30發射過濾器)設置進行掃描，獲得分析使用的凝膠圖像。另需制作一塊制備膠，步驟同2D-DIGE，其上樣為1 000 μg內標蛋白，電泳后考馬斯亮藍進行染色用于差異蛋白的質譜鑒定。

1.2.2.4 圖像分析 用DeCyder 5.0軟件分析2DDIGE圖像。首先對每一張膠圖上的所有蛋白質點掃描進行膠內分析，對不同膠的同一個蛋白質點與內標匹配，檢測每個點的容積(背景刪減后)、面積、峰值，計算每組(Cy3/Cy2，Cy5/Cy2)成像的標準豐度比值;然后對不同膠上的同一個蛋白質點與內標匹配，進行膠間分析，對匹配后每個蛋白質點的相對量進行比較分析后確定差異蛋白，篩選分析圖像出現并比率≥1.5，P≤0.05的差異點。在制備膠上找到與分析膠上的差異點匹配的質點，取點、脫色、酶解及樣品萃取，用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術進行檢測，獲取肽質量指紋圖譜及PKL文件，在NCBInr蛋白質數據庫中進行蛋白質匹配。

1.2.3 統計學方法 采用 SAS12.0統計軟件，差異蛋白質分析用One Way ANOVA方法。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 圖像分析 使用DeCyder5.0軟件分析，在每塊膠圖上檢測到蛋白斑點約1 300個。DN患者血漿與健康對照血漿比較，上調或下調1.5倍為截斷值，同時滿足P＜0.05的差異斑點有6個，見圖1。

2.2 差異表達蛋白鑒定 質譜分析并通過蛋白質數據庫(UniProtKB/Swiss-Prot)比對鑒定出6種蛋白質，分別為補體C3、C4、凝溶膠蛋白前體、纖維蛋白原γ、載脂蛋白E和細胞骨架蛋白16。見表1。

圖1 DN患者血漿差異表達蛋白質分布峰度圖

表1 差異表達蛋白鑒定結果

3 討論

DN的發病受多種因素影響，發病機制至今未完全闡明［4～6］。蛋白質組學技術作為一種全新的系統生物學研究方法，為揭示DN的病因病機提供了幫助［7］。蛋白質組學是對機體、組織或細胞的全部蛋白質表達水平、蛋白修飾與功能、蛋白之間相互作用等進行高通量的篩選和分析，比傳統的單個基因研究或單個蛋白研究更能增加疾病診斷、預后判斷的可靠性，更能準確反映機體的狀態［8，9］。本研究用蛋白質熒光染料標記DN及健康對照的蛋白質，進行2D-DIGE，并掃描獲得分析使用的凝膠圖像。對掃描后的熒光染料標記分析膠圖像進行圖像分析，分析后確定差異蛋白。

本研究成功構建了2D-DIGE DN患者血漿蛋白圖譜，并分析鑒定出6種差異表達蛋白;質譜分析并通過蛋白質數據庫(UniProtKB/Swiss-Prot)對比鑒定出6種蛋白質，分別為補體C3、C4、凝溶膠蛋白前體、纖維蛋白原γ、載脂蛋白E和細胞骨架蛋白16，為進一步篩選DN血漿蛋白標志物提供依據。

補體C3是人體重要的免疫球蛋白，參與機體體液免疫激活過程，其分子量為195 kD，主要由巨噬細胞和肝臟合成，在C3轉化酶的作用下，裂解成C3a和C3b兩個片段，在補體經典激活途徑和旁路激活途徑中均發揮重要作用。本研究中補體C3在DN患者與正常人群中呈現差異表達，提示其參與了DN的發生與發展過程，可作為DN的重要血漿分組標志物［10，11］。載脂蛋白E是一種多態性蛋白，參與脂蛋白的轉化與代謝過程，其基因可調節許多生物學功能，與多種代謝疾病有關。近年研究顯示，載脂蛋白E與機體免疫調節功能有關，在一定程度上可抑制機體過度免疫反應，包括抑制T細胞的增殖與趨化，調節巨噬細胞吞噬功能，從而達到調節機體炎癥免疫反應［12，13］。本研究通過 2D-DIGE，發現DN患者與正常人群中載脂蛋白E存在表達差異，提示其可能參與了DN的發病過程，并可能作為其早期預警的分子標志物［14，15］。

總之，本研究采用血漿蛋白質組學技術，應用2D-DIGE，初步篩選出了DN與正常人群差異表達的血漿蛋白，為下一步進行的前瞻性大規模臨床對照研究提供了一定的理論和實踐依據。

［1］Ma ZJ，Sun P，Guo G，et al.Association of the HLA-DQA1 and HLA-DQB1 alleles in type 2 diabetes mellitus and diabetic nephropathy in the Han Ethnicity of China［J］.J Diabetes Res，2013，2013:452537.

［2］蔣偉，劉麗秋.糖尿病腎病發病機制研究進展［J］.山東醫藥，2008，48(10):107-108.

［3］陸菊明，潘長玉.糖尿病腎病的流行病學和診斷標準［J］.中華老年多器官疾病雜志，2002，1(3):163-165.

［4］Starkey JM，Tilton RG.Proteomics and systems biology for understanding diabetic nephropathy［J］.J Cardiovasc Transl Res，2012，5(4):479-490.

［5］Thongboonkerd V，Barati MT，McLeish KR，et al.Proteomics and diabetic nephropathy［J］.Contrib Nephrol，2004，141:142-154.

［6］Xiao L，Wang M，Yang S，et al.A glimpse of the pathogenetic mechanisms of Wnt/-catenin signaling in diabetic nephropathy［J］.Biomed Res Int，2013，2013:987064.

［7］Merchant ML，Klein JB.Proteomics and diabetic nephropathy［J］.Semin Nephrol，2007，27(6):627-636.

［8］Thongboonkerd V.Searching for novel biomarkers and new therapeutic targets of diabetic nephropathy using proteomics approaches［J］.Contrib Nephrol，2008，160:37-52.

［9］劉洋，桂玉敏，袁勃，等.2型糖尿病蛋白質組學研究進展［J］.基礎醫學與臨床，2009，29(5):551-554.

［10］Wang B，Li Q，Jiang Y，et al.Serum complement C3 has a stronger association with insulin resistance than high sensitive C-reactive protein in non-diabetic Chinese［J］.Inflamm Res，2011，60(1):63-68.

［11］Raparia K，Usman I，Kanwar YS.Renal morphologic lesions reminiscent of diabetic nephropathy［J］.Arch Pathol Lab Med，2013，137(3):351-359.

［12］Eleftheriadis T，Antoniadi G，Pissas G，et al.The renal endothelium in diabetic nephropathy［J］.Ren Fail，2013，35(4):592-599.

［13］Quezada C，Alarcon S，Jaramillo C，et al.Targeting adenosine signaling to treatment of diabetic nephropathy［J］.Curr Drug Targets，2013，14(4):490-496.

［14］Furukawa M，Gohda T，Tanimoto M，et al.Pathogenesis and novel treatment from the mouse model of type 2 diabetic nephropathy［J］.J Sci World，2013，2013:928197.

［15］Dwyer JP，Lewis JB.Nonproteinuric diabetic nephropathy:when diabetics don't read the textbook［J］.Med Clin North Am，2013，97(1):53-58.