益生菌混合發酵酸豆乳的工藝條件優化*

郭穎，涂順明，駱練，劉新征，鄭芳燕

(中國食品發酵工業研究院，北京，100015)

目前市場上常見的益生菌酸乳是以牛乳為原料的酸牛乳，而以大豆為原料的益生菌發酵酸豆乳產品比較罕見。這主要是因為益生菌在豆乳中不易生長，豆乳中缺乏益生菌所能利用的乳糖，發酵后的產品酸度和菌數明顯低于酸牛乳，另一重要原因是豆乳發酵后會產生一些不良風味和豆腥味，影響消費者的接受度［1］。本研究通過優化適合豆乳發酵的益生菌菌種和合理的工藝，較好地解決了上述問題。

益生菌酸豆乳通常是指大豆萃取液(豆乳)經益生菌發酵制成的一種外觀頗似酸奶、具有獨特豆香味的健康食品。本研究采用動/植物來源的菌種結合對豆乳進行發酵研究，其中優選的植物乳桿菌廣泛存在于泡菜中，是一種安全無害的有益菌種。由于大豆和泡菜均屬于植物性原料，因此具有一定的發酵相似性。實驗證明，植物乳桿菌對豆乳發酵有其特點和優勢［2］。將馴化后的動物性來源的菌種(嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌)和植物性來源的菌種(植物乳桿菌)進行混種發酵，并確定酸豆乳生產過程中的適宜發酵條件，開發出高品質的益生菌發酵酸豆乳產品，可為優質大豆酸乳產業化提供基礎研究數據。

1 材料與方法

1.1 材料

大豆、全脂乳粉、蔗糖，市售。

1.2 菌種

嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus，St)、保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus，Lb)、植物乳桿菌植物亞種(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum，Lp)，均由中國食品發酵工業研究院植物蛋白研究中心提供。

1.3 培養基

脫脂乳培養基［3］:配制12%的全脂復原乳，100℃，30 min煮沸，自然冷卻。待出現脂肪層后，取下層乳液分裝于試管1/3處，121℃，15 min滅菌，冷卻，低溫保藏。用于工作發酵劑的制備。

MC培養基:按 GB 4789.35—2010附錄 A方法配制。用于嗜熱鏈球菌的活化、母發酵劑的制備和平板計數。

MRS培養基:按 GB 4789.35—2010附錄 A方法配制。用于保加利亞乳桿菌的活化、母發酵劑的制備和平板計數，以及乳酸菌菌落總數的平板計數。

CM0006 MRS培養基:酪蛋白胨 10.0 g，牛肉粉8.0 g，酵母粉 4.0 g，葡萄糖 20.0 g，MgSO40.2 g，乙酸鈉 5.0 g，檸檬酸三銨 2.0 g，K2HPO42.0 g，MnSO20.05 g，吐溫 80 1.0 g，蒸餾水 1 000 mL。pH(6.2 ±0.2)。固體培養基可添加 CaCO320.0 g，瓊脂 15.0 g。用于植物乳桿菌的活化、母發酵劑的制備和平板計數。

1.4 儀器與設備

HDL潔凈工作臺，北京東聯哈爾儀器公司;LDZX-30FB壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠;SPX-150BⅢ生化培養箱，天津泰斯特儀器公司;PHS-3C型精密pH計，上海雷磁儀器廠;NDJ-8S數字式黏度計，上海尼潤智能科技有限公司;九陽豆漿機，JYDZ，濟南九陽電器有限公司。

1.5 工藝流程和簡要說明

大豆經清洗后按豆水質量比1∶6磨漿，100目過濾，得到蛋白質含量為3%左右的豆乳，再經配料和均質，121℃，15 min滅菌，冷卻接種，按設定溫度發酵，4℃冷藏，12 h后制得益生菌酸豆乳。

1.6 方法

1.6.1 發酵用菌種的活化

將St、Lb和Lp分別接種于 MC、MRS和 CM0006 MRS培養基中，37℃恒溫培養48 h，活化2～3代備用。

1.6.2 母發酵劑和工作發酵劑的制備

將充分活化后的St、Lb和Lp于固體斜面培養基上分別轉接于MC、MRS和CM0006 MRS液體培養基中，37℃搖床培養48 h，制作成母發酵劑。

將母發酵劑按照3%的接種量接種于脫脂乳培養基中，3種菌分別于43、43、37℃恒溫培養48 h，制作成工作發酵劑。

1.6.3 發酵用菌種的馴化

豆乳與牛乳成分上的主要區別在于豆乳中不含乳糖，致使益生菌在豆乳中不能很好地生長繁殖。將St、Lb和Lp工作發酵劑按5%的接種量分別接種于12%的全脂復原乳(蛋白質3%)中，在43、43、37℃的條件下恒溫培養，待培養液凝固后再傳至下一代。在此過程中，逐步用3%蛋白含量的豆乳代替牛乳，并逐漸增加豆乳量，如此繼代培養，直至益生菌可以適應100%純豆乳的生長環境［4］。

1.6.4 優化酸豆乳發酵條件的單因素實驗設計

1.6.4.1 St、Lb 和 Lp 混種發酵菌種配比對發酵豆乳的影響

在前期試驗的基礎上，確定了St和Lb的比例為1∶1為宜，因此，如何將Lp按照適當的比例與另外兩種菌混合發酵是本次試驗的重點。

取100 mL豆乳(3%蛋白)，添加一定量的蔗糖，分裝滅菌后冷卻到40℃，將St、Lb和Lp按照4∶4∶1、2∶2∶1、1∶1∶1、1∶1∶2、1∶1∶4的比例接種，接種量為5%，40℃恒溫發酵5 h，之后4℃冷藏，后熟12 h，測定酸度。

1.6.4.2 接種量對發酵豆乳的影響

取100 mL豆乳(3%蛋白)，添加一定量的蔗糖，分裝滅菌后冷卻到40℃，將St、Lb和Lp按照1∶1∶1的比例接種，接種量分別為1%、3%、5%、7%、9%，40℃恒溫發酵5 h，之后4℃冷藏，后熟12 h，測定酸度。

1.6.4.3 發酵溫度對發酵豆乳的影響

取100 mL豆乳(3%蛋白)，添加一定量的蔗糖，分裝滅菌后分別冷卻到31、34、37、40和43℃，將 St、Lb和Lp按照1∶1∶1的比例接種，接種量為5%，按以上溫度恒溫發酵5 h，之后4℃冷藏，后熟12 h，測定酸度。

1.6.4.4 發酵時間對發酵豆乳的影響

取100 mL豆乳(3%蛋白)，添加一定量的蔗糖，分裝滅菌后分別冷卻到40℃，將St、Lb和Lp按照1∶1∶1的比例接種，接種量為5%，40℃恒溫發酵3、4、5、6、7、8 h，之后 4 ℃冷藏，后熟 12 h，測定酸度。

1.7 指標測定

酸度:采用GB 5413.34-2010方法;黏度:采用NDJ-8S數字式黏度計;菌落總數:采用GB 4789.35—2010方法。

1.8 感官評價

對于感官評價標準，將豆腥味和乳清析出作為研究重點，評價標準見表1。

表1 豆腥味和乳清析出情況評價標準Table 1 Standards of beany flavor and whey separation evaluation for fermented soybean milk

1.9 優化酸豆乳發酵條件的正交試驗設計

在單因素試驗結果的基礎上，以酸豆乳的酸度為指標，以菌種配比(A)、接種量(B)、發酵溫度(C)、發酵時間(D)4個影響因素，設計L9(34)的正交試驗，優化發酵條件，因素水平見表2。

表2 正交試驗因素水平表Table 2 Factors and levels table of the orthogonal test

2 結果與分析

2.1 菌種的馴化結果

通過多次馴化后，得到圖1的結果。由圖1可以看出，隨著豆乳含量的增加，St在培養液中酸度呈先增加后減少的趨勢，酸度在豆乳含量為80%時達到最高;Lb在培養液中，酸度呈逐漸減少的趨勢，酸度在豆乳含量為0%時為最高;Lp在培養液中，其酸度從含20%豆乳時開始呈先升高后下降的趨勢，酸度在豆乳含量為80%時達到最高。在100%純豆乳中，St和Lp的生長情況良好，酸度都能達到70.0°T以上(酸牛乳標準值)，但St酸度略低，而Lp酸度最高。

圖1 St、Lb與Lp在馴化過程中不同發酵樣品酸度的變化Fig.1 Acidity changes of different samples fermented by St，Lb and Lb during domesticating

由表3可以看出，馴化前3種菌在純豆乳中的生長情況均不好，發酵終產品的菌數均偏低，未達到發酵乳國標中對菌數的要求(≥1×106CFU/mL)。馴化后，3種菌最終發酵產品的菌數均有所提高，尤其是St和Lp發酵產品，達到了國標要求，雖然Lb的發酵產品菌數仍未達標，但與馴化前相比，增加了一個數量級，說明馴化結果基本符合要求。

從馴化后的感官效果看:St發酵產品凝乳時間短，凝固效果好，基本無乳清析出，但有豆腥味，且組織較粗糙;Lb發酵產品凝乳時間較長，凝固效果較好，組織細膩，豆腥味極輕，有豆香味，但乳清析出較嚴重。Lp發酵產品凝乳時間短，凝固效果好，基本無乳清析出，醇香，無豆腥味，但有顆粒物感，不夠細膩。為了獲得更優質的酸豆乳產品，需綜合馴化后的三種菌的優勢，對其進行混種發酵研究和確定最佳工藝條件。

表3 St、Lb與Lp在馴化前后發酵豆乳的結果比較Table 3 Comparison of results of different samples fermented by St，Lb and Lb before and after domestication

2.2 St、Lb和Lp混種發酵菌種配比對發酵豆乳的影響

從圖2和表4結果看，隨著St和Lb的增加，產品的酸度逐漸降低，有部分乳清析出，以及輕微豆腥味;當提高Lp的量時，產品的酸度逐漸增加(幅度不大)，終產品伴有淡豆香味，幾乎無豆腥味，但Lp量的增加產品會有顆粒物感，組織不夠細膩。因此，綜合上述結果，St、Lb 和 Lp 最佳配比為 1∶1∶1。

圖2 St、Lb與Lp混種發酵菌種配比對發酵豆乳酸度的影響Fig.2 Effect of ratio of strains on the acidity of soybean milk fermented by St，Lb and Lp

表4 St、Lb與Lp在不同配比下制得的發酵豆乳的感官評價Table 4 Sensory evaluation for soybean milk fermented by St，Lb and Lb at different ratios

2.3 接種量對發酵豆乳的影響

圖3 St、Lb與Lp混種發酵接種量對發酵豆乳酸度的影響Fig.3 Effect of inoculum amount on the acidity of soybean milk fermented by St，Lb and Lp

從圖3可知，產品的酸度隨著接種量的增加而增加，當接種量為5%時酸度達到最高值，隨后變化不大。從表5中感官指標看，接種量5%時，產品無乳清析出，組織狀態細膩潤滑，有淡豆香味，無豆腥味。因此，確定最適接種量為5%。

表5 St、Lb與Lp在不同接種量下制得的發酵豆乳的感官評價Table 5 Sensory evaluation for soybean milk fermented by St，Lb and Lb at different inoculum amounts

2.4 發酵溫度對發酵豆乳的影響

從圖4和表6結果可知，隨著發酵溫度的提高，產品的酸度逐漸升高，乳清析出逐漸減少，豆腥味逐漸減輕，豆香味逐漸增加，40℃時呈現了最佳值，但當發酵溫度為43℃時，酸度明顯下降，豆腥味亦有所增加。因此，確定最適發酵溫度為40℃。

圖4 St、Lb與Lp混種發酵溫度對發酵豆乳酸度的影響Fig.4 Effect of temperature on the acidity of soybean milk fermented by St，Lb and Lp

表6 St、Lb與Lp在不同溫度下制得的發酵豆乳的感官評價Table 6 Sensory evaluation for soybean milk fermented by St，Lb and Lb at different temperatures

2.5 發酵時間對發酵豆乳的影響

從圖5看，發酵前段隨著發酵時間的增加，產品酸度逐漸提高，發酵時間5～7 h時，酸度達到最高值并基本保持穩定，7 h后酸度有所下降。從表7感官結果看，發酵5 h時，產品沒有豆腥味，亦無乳清析出，感官狀態好。因此，確定最佳發酵時間為5 h。

圖5 St、Lb與Lp混種發酵時間對發酵豆乳酸度的影響Fig.5 Effect of time on the acidity of soybean milk fermented by St，Lb and Lp

表7 St、Lb與Lp在不同時間下制得的發酵豆乳的感官評價Table 7 Sensory evaluation for soybean milk fermented by St，Lb and Lb at different times

2.6 正交試驗結果

由于酸度是衡量酸乳中益生菌發酵優劣的一個重要指標［5］，因此，在上述單因素試驗的基礎上，以酸度值作為評價指標進行正交試驗，結果見表8。

表8 正交試驗數據分析表Table 8 Analysis of results table of the orthogonal test

由表8可知，發酵溫度對酸度的影響最為顯著，各因素對酸度影響的主次順序為:發酵溫度C＞發酵時間 D＞接種量 B＞菌種配比 A，最優條件為A2B2C2D2，即菌種配比 1∶1∶1，接種量 5%，發酵溫度40℃，發酵時間5 h。

2.7 驗證實驗

根據正交試驗確定的最優發酵條件，進行3次平行實驗，得到的發酵酸豆乳的酸度為98.7°T，高于表中各項的實驗結果，證實了正交試驗優化結果的可靠性。在此最優發酵條件下，開發的發酵酸豆乳測定結果是:酸度 98.7 °T，黏度 3 875 mPa·s，菌數達到5.63×108CFU/g，而且產品凝乳效果好，無乳清析出，無豆腥味，口感細膩潤滑，呈乳白色。

3 結論

(1)通過對所使用的3種菌種分別進行馴化，使其最終均能適應100%純豆乳的生長環境。若將3種菌進行混種發酵，可相互取長補短，發揮更大的效果，為開發優質大豆酸乳奠定了良好的基礎。

(2)通過單因素和正交試驗，確定了利用嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌和植物乳桿菌發酵100%純豆乳的最佳工藝條件是:菌株配比1∶1∶1、接種量5%、發酵溫度40℃、發酵時間5 h。在此優化條件下，開發的發酵酸豆乳產品在酸度和益生菌菌數方面均達到了酸乳國標要求，而且產品無豆腥味，口感風味和感官狀態好，可為優質大豆酸乳加工提供技術參考。

［1］ 代養勇，曹健，董海洲，等.大豆食品豆腥味研究進展［J］.中國糧油學報，2007，22(4):50-53.

［2］ 曲冬梅，劉小杰.植物乳桿菌及其在食品工業中的應用［J］.中國食品添加劑，2008(增刊1):219-222.

［3］ 劉景春，楊桂玲，張嶺.雙歧桿菌新型保健酸豆奶的生產工藝［J］.大豆通報，2002(4):24-25.

［4］ Naveed Ahmad，Li Li，Yang Xiaoquan，et al.Survivability and growth effects of three Lactobacillus cultures on texture and flavor aspects of soymilk［J］.Modern Food Science and Technology，2008，24(4):301-308.

［5］ 張麗萍，楊晨，王成強，等.干酪乳桿菌在酸奶生產中的應用研究［J］.中國乳品工業，2007，35(2):23-26.