產鼠李糖脂生物表面活性劑大腸桿菌的構建與優化

鞏志金，彭彥峰，張煜婷，宋國田，陳五九，賈士儒，王欽宏

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產鼠李糖脂生物表面活性劑大腸桿菌的構建與優化

鞏志金1,2，彭彥峰2，張煜婷2，宋國田1,2，陳五九2，賈士儒1，王欽宏2

1 天津科技大學生物工程學院，天津 300457 2 中國科學院天津工業生物技術研究所 中國科學院系統微生物工程重點實驗室，天津 300308

鞏志金, 彭彥峰, 張煜婷, 等. 產鼠李糖脂生物表面活性劑大腸桿菌的構建與優化. 生物工程學報, 2015, 31(7): 1050–1062.Gong ZJ, Peng YF, Zhang YT, et al. Construction and optimization of Escherichia coli for producing rhamnolipid biosurfactant. Chin J Biotech, 2015, 31(7): 1050–1062.

目前鼠李糖脂生物表面活性劑主要由條件致病的銅綠假單胞菌生產獲得，從而影響工業應用。為了開發一種相對安全的鼠李糖脂生產菌，將帶有不同強度組成型合成啟動子的鼠李糖基轉移酶基因 (Rhamnosyltransferase gene,) 以單、中、高3種拷貝數分別在大腸桿菌ATCC 8739中異源表達，實現了不同產量的鼠李糖脂異源合成。對基因和基因簇 (TDP-L-鼠李糖合成的基因簇) 進一步利用合成啟動子進行組合調控，篩選獲得了最優生產鼠李糖脂工程菌——大腸桿菌TIB-RAB226。對大腸桿菌TIB-RAB226進行發酵溫度優化，鼠李糖脂產量達到124.3 mg/L，是優化前的1.17倍。通過分批補料發酵，12 h時鼠李糖脂產量達到209.2 mg/L。對發酵產物進行高效液相色譜-質譜聯用技術分析，共檢出相對含量變化的5類質核比不同的鼠李糖脂同系物。本研究可為異源合成產鼠李糖脂提供重要參考。

鼠李糖脂，鼠李糖基轉移酶，基因簇，組成型合成啟動子，組合調控，大腸桿菌

鼠李糖脂是一種由多種同族結構組成的陰離子生物表面活性劑，其親水基團一般由1?2分子的鼠李糖環構成，疏水基團則由不同碳鏈的β-羥基烷酸構成，分子式可表述為Rhl-Cx、Rhl-Cx-Cy、Rhl-Rhl-Cx或Rhl-Rhl-Cx-Cy (Rhl為鼠李糖；x、y通常為8–14)[1]。鼠李糖脂能顯著降低流動相之間的界面張力，具有優良的去垢、乳化和絮凝能力，并且無毒及可生物降解，在采油工業、化妝品、環境修復中具有巨大的應用潛力[2]。另外，通過微生物發酵生產鼠李糖脂并水解得到鼠李糖，有望替代天然植物中提取獲得的鼠李糖，成為食用型甜味劑鼠李糖的潛在來源[3]。

目前，工業上主要采用銅綠假單胞菌發酵法生產鼠李糖脂[4]，而銅綠假單胞菌(俗稱綠膿桿菌) 被認為是三種最強人類條件致病菌之一，限制了其在工業生產中的應用[5]。因此，人們期望利用相對安全的工業微生物進行鼠李糖脂的生產，降低其在生產中的潛在危害，拓展相關產品的應用范圍[6]。如利用伯克氏菌[7]、綠針假單胞菌[8]等非條件致病菌生產鼠李糖脂，但由于這些微生物遺傳背景相對不清晰且缺乏簡便的遺傳操技術，很難進一步提高鼠李糖脂的產量，無法滿足生產要求。而大腸桿菌作為一種遺傳背景清晰、技術操作成熟、工業應用廣泛的模式生物，具有完整的TDP-L-鼠李糖和β-羥基烷酸 (HAAs)合成途徑 (圖1)，被認為是更具改造潛力的良好宿主菌。Wang等利用轉座體介導的染色體整合的方法，將合成鼠李糖脂的關鍵基因整合入大腸桿菌BL21 (DE3) 基因組，并成功進行異源表達，在IPTG的誘導下生產鼠李糖脂，產量達到約 80 mg/L[9]。Cabrera-Valladares等將基因導入大腸桿菌W3110未得到鼠李糖脂，將基因和(銅綠假單胞菌鼠李糖合成基因簇) 基因簇一起導入時，鼠李糖脂產量達到120.6 mg/L，證明了TDP-L-鼠李糖是鼠李糖脂異源生產的一個主要影響因素[10]。雖然鼠李糖脂在大腸桿菌中生產取得了一定程度的成功，但由于其前體物質主要來自大腸桿菌的核心代謝途徑 (圖1)，導致細胞不易于過量生產鼠李糖脂[5,11]。因此，需要通過代謝工程的策略進一步提高其前體物的表達量和平衡代謝流量，提高鼠李糖脂的產量[12]。

本研究中我們構建了產鼠李糖脂的大腸桿菌，并利用組成型合成啟動子對相應的關鍵基因進行了組合調控，鼠李糖脂產量得到較大提高，而且不用誘導表達，避免使用相對昂貴的誘導劑。研究首先將鼠李糖脂合成的關鍵基因在ATCC 8739中進行表達優化，然后利用合成啟動子與基因簇進行組合調控，得到最優鼠李糖脂生產菌TIB-RAB226。最后，對工程菌TIB-RAB226進行了發酵溫度的優化和分批補料發酵，進一步提高了鼠李糖脂的產量。對發酵產物進行高效液相色譜-質譜聯用 (LC-MS) 技術分析，發現工程大腸桿菌產生的鼠李糖脂含有多種不同類型和相對豐度的鼠李糖脂同系物 (Congener)。

圖1 工程大腸桿菌鼠李糖脂生物合成途徑

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

TIB-R02基因組DNA用作克隆基因的模板。ATCC 8739是構建產鼠李糖脂大腸桿菌的出發菌株。本研究所用菌株如表1所示。

1.1.2 主要試劑

氨芐青霉素、氯霉素、硫酸卡那霉素購自上海生工生物工程服務有限公司；質粒小量快速提取試劑盒購自美國Axygen 公司；DNA 回收試劑盒購自康為世紀公司；TransStart Fast Pfu DNA 聚合酶、DNA marker、pEASY-Blunt Zero Cloning Kit試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司；限制性內切酶、T4 DNA 連接酶、T4 多聚核苷酸激酶購自NEB公司；蘇丹紅II、液體石蠟油、鼠李糖標準品購自國藥集團化學試劑有限公司；其他試劑均為分析純。

表1 本研究的菌株

1.2 方法

1.2.1 培養基

每升LB培養基包括10 g胰蛋白胨, 5 g酵母提取物和10 g氯化鈉 (固體LB加入1.5%的瓊脂粉)；鼠李糖脂發酵培養基為添加氨芐青霉素、硫酸卡那霉素和后期補加1%() 葡萄糖的LB 培養基；氨芐青霉素、硫酸卡那霉素、氯霉素終濃度分別為100 μg/mL、50 μg/mL和34 μg/mL。

1.2.2 鼠李糖脂檢測

采用排油圈法[13]對鼠李糖脂含量進行檢測，并對方法簡單改進。玻璃平皿 (D=9 cm) 中加入25 mL的液體LB，液面穩定后加入1 mL蘇丹紅Ⅱ染紅的液體石蠟。待石蠟鋪開至半徑為20 mm時，加入10 μL鼠李糖脂發酵液并記錄最大排油圈半徑。根據排油圈半徑(mm) 與鼠李糖脂濃度(g/L) 之間的線性關系=0.097 4+ 0.12，計算發酵液中鼠李糖脂的含量。本實驗所使用的排油圈法已經與苔黑酚-濃硫酸顯色法[9]進行對比驗證，兩種方法結果一致。

1.2.3 質粒及重組片段的構建

本研究所使用的質粒、引物分別見表2和表3。分別構建含不同表達強度組成型合成啟動子的高拷貝數質粒pEASY-XRhlAB (X代表P164、P230和P346 3種低、中、高不同表達強度的組成型啟動子，啟動子序列見表3[14]) 和中等拷貝數質粒pET-XRhlAB，作為鼠李糖基轉移酶基因的質粒表達載體，構建方法如下：1) pEASY-XRhlAB質粒的構建：以TIB-R02基因組DNA為模板，通過PCR擴增獲得帶有不同表達強度組成型啟動子的XRhlAB DNA片段 (分別以P164A-5/T7tB-3，P230A-5/ T7tB-3和P346A-5/T7tB-3為引物對)。將純化后的XRhlAB DNA片段與pEASY-Blunt Zero連接后得到pEASY-XRhlAB表達載體。2) pET-XRhlAB質粒的構建：以pEASY-XRhlAB為模板，通過PCR擴增獲得帶有HⅠ和RⅠ酶切位點的XRhlAB基因片段，與pET-30a(+) 載體一起經酶切、連接后得到pET-XRhlAB表達載體。

整合到基因組中的XRhlAB DNA片段構建如下：用上述相同方法獲得XRhlAB片段，將XRhlAB片段純化、磷酸化處理后與pEASY-ap (帶有兩端各500 bp同源臂序列質粒) 質粒連接獲得帶有500 bp同源臂的質粒pEASY-XRhlAB-ap。以pEASY-XRhlAB-ap和pEASY-cat-SacB-ap (兩端各帶有500 bp同源臂序列，同源臂之間含有抗性基因簇的質粒) 為模板，用引物P1和P2分別擴增獲得帶同源臂XRhlAB-ap和cat-SacB-ap的DNA片段。cat-SacB-ap、XRhlAB-ap DNA片段分別用于第一步和第二步同源重組的片段，將XRhlAB DNA片段整合進大腸桿菌基因組，代替基因。

用于基因簇啟動子替換的片段構建如下：以質粒pEASY-cat-SacB-ap為模板利用引物Sens-cat-Sacb/Anti-cat-Sacb 進行擴增，獲得帶有50 bp同源臂的rha-cat-SacB DNA片段，用于第一步同源重組。直接通過基因合成帶有上述不同組成型啟動子和50 bp同源臂的P164-rha、P230-rha和P346-rha片段用于第二步同源重組。

1.2.4 工程菌的構建

將pET-XRhlAB質粒轉入ATCC 8739得到3種中等拷貝數質粒表達基因的工程菌PET164、PET230、PET346；將pEASY-XRhlAB質粒轉入ATCC 8739得到3種高拷貝數質粒表達基因的工程菌PSY164、PSY230、PSY346；另外，通過兩步同源重組的方法[16-17]將XRhlAB DNA片段整合到ATCC 8739基因組替換基因，得到3株以單拷貝數表達基因的工程菌PGE164、PGE230和PGE346。上述9株菌用于基因異源表達合成鼠李糖脂的研究。

表2 本研究所用的質粒

將ATCC 8739基因組中基因簇的原始啟動子用上述不同強度的啟動子替換，構建以不同強度表達基因簇的工程菌Rha-164、Rha-230及Rha-346。將質粒pET- 164RhlAB、pET-230RhlAB 及pET-346RhlAB分別導入菌株Rha-164、Rha-230及Rha-346，得到9種組合菌株(Rha164-RAB164、Rha164- RAB230、Rha164-RAB346、Rha230-RAB164、Rha230-RAB230、Rha230-RAB346、Rha346- RAB164、Rha346-RAB230和Rha346-RAB346)，用于基因和基因簇組合調控 研究。

1.2.5 工程菌的篩選及發酵溫度優化

將構建的工程菌接種于含氨芐青霉素、硫酸卡那霉素的LB試管中，200 r/min、30 ℃培養24 h，通過鼠李糖脂產量對菌株進行篩選。利用篩選得到的最優工程菌TIB-RAB226進行發酵溫度的優化，將菌株TIB-RAB226依次接種于溫度為26、28、30、32、34和36 ℃的搖瓶培養基中，200 r/min，培養12 h，檢測菌體生長及鼠李糖脂產量確定最優的發酵 溫度。

1.2.6 鼠李糖脂的補料發酵及產物分析

為了進一步提高鼠李糖脂的產量，采用搖瓶補料的方式對菌株TIB-RAB226進行補料發酵實驗。將種子液培養至600=3，以5%的接種量接種至LB培養基，28 ℃、 200 r/min培養16 h，每2 h測定細胞生長密度、鼠李糖脂產量及pH，并在8 h時進行補加1%葡萄糖補料實驗。將發酵產物用萃取液 (氯仿：乙醇=2：1) 萃取后吹干有機溶劑得到鼠李糖脂樣品，用于高效液相色譜-質譜聯用 (LC-MS) 分析。LC-MS分析方法參照Wang等[9]所用方法并簡單修改，色譜柱為Genmini C18柱 (100 mm×3.0 mm, 3 μm)，流動相A為水：乙腈=98：2，B為水：乙腈=10：90，A和B中均含1%乙酸。梯度洗脫條件為0?1 min，8%；1?51 min，60%；51?61 min，60%；61?62 min，8%；62?67 min，8%。流速為0.5 mL/min，進樣體積為10 μL。質譜條件：對鼠李糖脂樣品采用陰離子模式，電噴霧毛細管噴口電離電壓4.2 kV，霧化氣和干燥氣均為氮氣，噴霧氣壓力為1.0 Pa，干燥氣溫度180 ℃、流速為5.0 L/min，質譜掃描范圍為100?1 000 (m/z)。

表3 本研究所用的引物

The underlined is the sequence of synthetic promoter corresponding to the primer name.

2 結果與分析

2.1 rhlAB基因的異源表達合成鼠李糖脂

基因編碼的鼠李糖基轉移酶既能夠催化生成β-羥基烷酸 (HAAs)，又能將HAAs 與TDP-L-鼠李糖結合生成鼠李糖脂，是生產鼠李糖脂的關鍵酶 (圖1)。同時，基因的拷貝數和啟動子強度是影響工程菌代謝產物生產的重要因素。本實驗以不同拷貝數形式表達帶有3種表達強度啟動子的基因，通過基因拷貝數和啟動子強度對基因的表達進行調控，獲得合適的表達形式。實驗結果如圖2所示，對照組發酵液中未檢測到鼠李糖脂 (數據未列出)。不同拷貝數之間的菌株產量差別明顯；相同拷貝數之間以不同強度啟動子表達基因的菌株產量差別較小。以上研究表明基因拷貝數在基因表達調控中占主導作用，而啟動子強度的影響較小。含中等拷貝數質粒表達基因的菌株，鼠李糖脂產量明顯高于以單拷貝數在基因組中表達基因的菌株和以高貝數質粒表達基因的菌株，表明中等拷貝數的pET-30a(+) 質粒更適合與不同強度的組成型啟動子結合表達基因，實現鼠李糖脂在大腸桿菌中的異源合成。因此，選擇帶不同啟動子強度表達基因的中等拷貝數質粒pET-164RhlAB、pET-230RhlAB和pET-346RhlAB作為基因的表達載體并進行進一步的表達調控。

2.2 rhlAB基因與rhaBDAC基因簇的啟動子組合調控

基因簇控制表達的TDP-L-鼠李糖是鼠李糖脂合成的主要前體物質和限制因素，本實驗中我們用不同強度啟動子表達基因簇，并將其與帶不同啟動子的基因進行組合調控，實驗結果如圖3所示，對照菌株為PET164、PET230及PET346，鼠李糖脂平均產量分別為71、62和56 mg/L。在相同條件下含P230啟動子的基因簇分別與pET-164RhlAB、pET-230RhlAB和pET-346RhlAB質粒進行組合調控得到的菌株Rha230-RAB164、Rha230-RAB230和Rha230- RAB346鼠李糖脂產量均高于其他組合調控的菌株，說明P230啟動子更適合替代基因簇原始啟動子與pET-164RhlAB、pET-230RhlAB、pET-346RhlAB質粒進行基因的組合調控，來提高鼠李糖脂的產量。9種組合菌株中Rha230-RAB346的產量最高，達到 106.6 mg/L。因此，選擇含P230啟動子的基因簇和含P346啟動子的中等拷貝數質粒pET-346RhlAB的菌株Rha230-RAB346進行下一步優化實驗，并將Rha230-RAB346命名為大腸桿菌TIB-RAB226。

圖2 rhlAB基因以不同形式在大腸桿菌表達時鼠李糖脂的產量

圖3 不同強度啟動子組合調控對大腸桿菌合成鼠李糖脂產量的影響

2.3 產鼠李糖脂大腸桿菌TIB-RAB226發酵溫度優化

雖然宿主、載體和克隆基因是影響重組菌產物合成的主要因素，但是其所處的環境條件也是一個不可忽略的因素，尤其是環境溫度的變化，不僅影響代謝過程中各種關鍵酶的活性及副產物的積累，而且還與質?？截悢档淖兓⑾⑾嚓P。因此，在發酵過程中需要采用一定的溫度控制策略來改善代謝產物的合成與積累[18]。我們對大腸桿菌TIB-RAB226的發酵溫度進行了優化，結果表明最適鼠李糖脂生產溫度為28 ℃，鼠李糖脂最高產量可達到124.3 mg/L (圖4)，與30 ℃相比產量提高1.17倍。當溫度進一步升高或低于28 ℃時，鼠李糖脂的產量都逐漸下降，36 ℃時鼠李糖脂產量下降為 64.1 mg/L，與28 ℃時最高產量相比下降約46.1%，降幅明顯。

2.4 產鼠李糖脂大腸桿菌TIB-RAB226的分批補料發酵

為了進一步優化鼠李糖脂的合成，對大腸桿菌TIB-RAB226進行了分批補料發酵實驗，測定了生產過程中細胞密度、鼠李糖脂產量及pH變化情況，結果如圖5所示。發酵前8 h菌體在LB培養基中生長，鼠李糖脂產量和菌體生物量同步增加，pH逐漸變堿性。當培養至8 h左右細胞生長開始進入穩定期，pH由7.0升至8.5，細胞生長趨于穩定，600=3.47，鼠李糖脂的生產速率減小，產量達到111.7 mg/L。此時向培養基中補加1%的葡萄糖并繼續發酵生產。在8?12 h階段鼠李糖脂產量快速增加，在12 h左右鼠李糖脂達到最高產量209.2 mg/L，是補料前的1.87倍。此時，由于補加葡萄糖后發酵液中逐漸積累副產物乙酸導致pH降至6左右，工程菌生長緩慢并停止合成鼠李糖脂。發酵至16 h時細胞生物量達到600=10.1，并趨于穩定，pH降至5左右，此時乙酸積累達到1.7 g/L，導致菌體生長基本停止，無法進行進一步的補料實驗。因此，要進一步改善鼠李糖脂的合成，需要對工程菌進行進一步的遺傳改造，阻斷副產物乙酸的合成與積累。

圖4 不同溫度對工程菌鼠李糖脂合成的影響

圖5 大腸桿菌TIB-RAB226的分批補料發酵生產

2.5 LC-MS對產物中鼠李糖脂的結構分析

對工程菌生產的鼠李糖脂分離純化進行了LC-MS分析，結果顯示大腸桿菌合成的鼠李糖脂含有5類質核比(/) 的鼠李糖脂同系物 (圖6)，其中/為333.1908和503.3215鼠李糖脂分別在30.8 min和61.9 min 被分離，為Rhl-C10和Rhl-C10-C10。另外，/為531.4、475.3、529.3的離子峰分別在34.3、52.4和 55.9 min 被分離，根據相關研究結果[9,19-20]，上述3種離子峰可能是另外3類單鼠李糖脂同系物，且均各含有2種分子量相同的鼠李糖脂同系物，分別為Rhl-C12-C10或Rhl-C10-C12，Rhl-C8-C10或Rhl-C10-C8，Rhl-C10-C12:1或Rhl-C12:1-C10。另外，根據LC-MS總離子流圖的峰面積，估算該大腸桿菌合成的5類鼠李糖脂同系物的相對含量如圖6所示，其中Rhl-C10-C12:1或Rhl-C12:1-C10組分的比例最大，相對豐度達到約55%。

圖6 大腸桿菌TIB-RAB226合成的鼠李糖脂同系物的相對含量

3 討論

目前，主要通過銅綠假單胞菌發酵法生產鼠李糖脂[4]，但是銅綠假單胞菌較強的條件致病性限制了其在工業生產中的應用。人們也嘗試通過很多非致病微生物來生產鼠李糖脂[6,21]，而大腸桿菌作為一種“一般認為安全 (GRAS)”的模式生物，具有清晰的遺傳背景、成熟的遺傳操作技術及廣泛的工業應用，是異源合成鼠李糖脂合適的選擇。我們將鼠李糖脂合成的關鍵基因在ATCC 8739中成功異源表達，并對相關基因利用不同強度的組成型合成啟動子進行組合調控，得到一株鼠李糖脂產量較高的大腸桿菌工程菌TIB-RAB226。利用LB培養基并補加1%葡萄糖發酵，在12 h左右鼠李糖脂產量達到最高的209.2 mg/L。與之前報道的利用大腸桿菌產鼠李糖脂的文獻[4-5]相比，鼠李糖脂的產量大幅提高。并且由于利用了組成型合成啟動子進行關鍵基因的組合調控，使得該工程菌在生產鼠李糖脂時不需要相對昂貴的IPTG誘導物，為簡化生產和降低成本奠定了基礎。

基因的拷貝數是影響基因異源表達的主要因素[22-23]。在我們的研究中，基因以單拷貝數形式在大腸桿菌中表達時，鼠李糖脂的產量很低，可能的原因是當在基因組中單拷貝數表達基因時產生的鼠李糖基轉移酶較少，導致其催化產生的鼠李糖脂較少。含中等拷貝數表達基因的菌株鼠李糖脂產量明顯高于高拷貝數表達基因的菌株，推斷一個可能的原因是以高拷貝數質粒表達外源基因時，目的基因表達量可能不再由質粒的拷貝數決定，而是由轉錄和翻譯水平決定，導致拷貝數與表達量之間為非正相關關系，鼠李糖脂的產量不高。另一個可能的原因是基因以高拷貝數在大腸桿菌表達時會增加菌體的代謝負擔，導致產率和轉化率降低，不利于鼠李糖脂的積累。

在和組合調控中，與帶中等強度的啟動子表達時獲得了最高鼠李糖脂產量，這有兩種可能的原因：一、在此組合調控條件下，TDP-L-鼠李糖的產生與消耗達到動態平衡，更有利于鼠李糖脂的生產；二、在表達使用P230啟動子合成TDP-L-鼠李糖的量最高，更適應合成鼠李糖脂的需要，這些可以通過分析基因的轉錄表達、前體物TDP-L-鼠李糖和HAA的量等來進一步研究。通過發酵溫度的優化發現基因在大腸桿菌表達實現鼠李糖脂合成的最適溫度為28 ℃，我們推測一方面可能是在此溫度下鼠李糖脂合成相關途徑的代謝流量更加平衡，另一方面可能是鼠李糖脂及其前體合成相關酶活性提高，更有利于鼠李糖脂的合成。LC-MS分析顯示我們的大腸桿菌 TIB-RAB226合成的均為單鼠李糖脂，這與之前的報道一致[6,24]，原因是大腸桿菌中缺乏鼠李糖基轉移酶2基因 () 無法將TDP-L-鼠李糖結合到單環鼠李糖脂中形成雙環的鼠李糖脂。不過來自我們的工程大腸桿菌的產物中，其同系物的相對豐度與Wang等[9]的還有一定的差異，Wang等在發酵產物中未檢測到Rhl-C10-C12:1或Rhl-C12:1-C10類型的鼠李糖脂，而Rha-C10-C10類型的鼠李糖脂含量較高，這可能是由出發宿主菌的不同造成的。

另外，β-羥基烷酸 (HAAs) 的代謝通量也會直接影響鼠李糖脂的生物合成，是鼠李糖脂合成的另一個關鍵前體物質，其代謝合成主要受脂肪酸合成途徑 (FAS-II) 和β-氧化途徑的影響[25-26]，我們下一步工作將對β-羥基烷酸合成途徑中相關酶進行代謝調控，進一步提高大腸桿菌合成鼠李糖脂的能力。

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(本文責編 陳宏宇)

Construction and optimization offor producing rhamnolipid biosurfactant

Zhijin Gong1,2, Yanfeng Peng2, Yuting Zhang2, Guotian Song1,2, Wujiu Chen2, Shiru Jia1, and Qinhong Wang2

1 College of Biotechnology, Tianjin University of Science & Technology, Tianjin 300457, China 2 Key Laboratory of Systems Microbial Biotechnology, Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China

Rhamnolipid biosurfactant is mainly produced bythat is the opportunistic pathogenic strain and not suitable for future industrial development. In order to develop a relatively safe microbial strain for the production of rhamnolipid biosurfactant, we constructed engineeredstrains for rhamnolipid production by expressing different copy numbers of rhamnosyltransferase () gene with the constitutive synthetic promoters of different strengths inATCC 8739. We further studied the combinatorial regulation ofgene andgene cluster for dTDP-l-rhamnose biosynthesis with different synthetic promoters, and obtained the best engineered strain—TIB-RAB226. Through the optimization of culture temperature, the titer of rhamnolipd reached 124.3 mg/L, 1.17 fold higher than that under the original condition. Fed-batch fermentation further improved the production of rhamnolipid and the titer reached the highest 209.2 mg/L within 12 h. High performance liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) analysis showed that there are total 5 mono-rhamnolipid congeners with different nuclear mass ratio and relative abundance. This study laid foundation for heterologous biosynthesis of rhanomilipd.

rhamnolipid, rhamnosyltransferase,gene cluster, constitutive synthetic promoter, combinatorial regulation,

November 25, 2014;

January 21, 2015

National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2014AA022104), Industrial Biotechnology Program of Tianjin Municipal Science and Technology Commission (No. 12ZCZDSY13000).

:Yanfeng Peng. Tel/Fax: +86-22-84861950; E-mail: peng_yf@tib.cas.cn Qinhong Wang. Tel/Fax: +86-22-84861950; E-mail: wang_qh@tib.cas.cn

國家高技術研究發展計劃(863計劃) (No. 2014AA022104)，天津市科學技術委員會工業生物技術專項 (No. 12ZCZDSY13000)資助。