重組β-葡萄糖醛酸苷酶鍵選擇性的半理性改造

普鴻麗，呂波，趙東旭，李春

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重組β-葡萄糖醛酸苷酶鍵選擇性的半理性改造

普鴻麗，呂波，趙東旭，李春

北京理工大學生命學院，北京 100081

普鴻麗, 呂波, 趙東旭, 等. 重組β-葡萄糖醛酸苷酶鍵選擇性的半理性改造. 生物工程學報, 2015, 31(7): 1119–1128.Pu HL, Lü B, Zhao DX, et al. Semi-rational modification for improving bond selectivity of recombinant β-glucuronidase. Chin J Biotech, 2015, 31(7): 1119–1128.

為了提高重組表達的β-葡萄糖醛酸苷酶 (PGUS-E) 的鍵選擇性，本研究以PGUS-E結構與功能關系的推測為指導，選擇了可能影響PGUS-E的鍵選擇性的R329、T369、N467位點進行定點飽和突變，利用薄層層析 (TLC) 和高效液相色譜 (HPLC) 對鍵選擇進行篩選，得到優勢突變酶R329K、T369V。結果顯示：與PGUS-E酶相比，突變酶R329K、T369V鍵選擇性分別提高26.9%、34.3%。突變酶的酶學性質研究表明，突變酶的最適pH和溫度與PGUS-E一致，但其酶催化效率下降。由此可見，R329、T369對酶催化的鍵選擇性和酶的活性有顯著影響。綜上結果，本文應用飽和突變方法改善了PGUS-E 的鍵選擇性，為酶的結構和功能關系理解提供了實驗依據。

β-葡萄糖醛酸苷酶，單葡萄糖醛酸基甘草次酸，鍵專一性，定點飽和突變

甘草酸(Glycyrrhizin, GL) 又稱甘草甜素[1]，是一種三萜皂苷類化合物，由五環三萜皂苷通過β-1,2糖苷鍵和β-1,3糖苷鍵與兩個葡萄糖醛酸相連構成。它具有抗炎、抗腫瘤、抗病毒等藥理效應，同時作為甜味劑、增香劑、穩定劑廣泛應用于化妝品、食品等行業中[2-5]。但由于其極性較強，溶解性不好，不能有效地穿透細胞膜發揮藥效，使其應用受到了很大的限制。與GL的相比，GL衍生物 (單葡萄糖醛酸基甘草次酸(Glycyrrhetinic acid monoglucuronide, GAMG)是一種甜度高、熱量低、安全性好的甜味劑，甜度是甘草酸的5倍多，蔗糖的941倍[6-7]，而且GAMG具有極性適中、溶解性好、易為人體吸收等特性，成為GL最理想的替代品。

β葡萄糖醛酸苷酶 (EC 3.2.1.31) 是一類能水解含有β葡萄糖醛酸基的糖苷類化合物，同時釋放出β-葡萄糖醛酸(GlcA) 和相應的苷元的酶，主要分布于糖苷酶水解酶家族1 (GH1)、家族2 (GH2) 和家族79 (GH79)，同屬于糖苷酶氏簇A (GH-A)[8-9]，目前報道過的不同微生物來源的β葡萄糖醛酸苷酶性質有所差異，但普遍存在酶表達效率不高、酶活性偏低、穩定性差、存在副反應等特點[10-11]，因此，如何獲得可以定向催化GL生成GAMG的β-葡萄糖醛酸苷酶成為甘草酸生物轉化的瓶頸。本實驗室前期在大腸桿菌原核系統中高效表達了來源于產紫青霉Li-3的β-葡萄糖醛酸苷酶(PGUS)[12-13]，但重組β-葡萄糖醛酸苷酶(PGUS-E) 的鍵選擇性相對于PGUS發生了改變，在水解GL的β-1,2糖苷鍵生成產物GAMG的同時亦會水解GAMG的β-1,3糖苷鍵生成副產物甘草次酸(GA)，造成產物GAMG專一性降低(圖1)。因此，利用蛋白質改造技術研究并改造PGUS-E的鍵選擇性及產物專一性使其更好地適應GAMG的工業化生產具有重要的應用價值。相比較非理性設計中突變文庫大、篩選難度大等缺點[14-15]，通過蛋白結構模擬和分析研究，將隨機突變限制在特定的區域上的半理性設計，可在較小的突變庫中獲得性質改善的突變體[16]，近年來被廣泛的應用于蛋白的定向改造。

本文以利用Pymol軟件對PGUS-E酶的模擬結構進行分析，理性預測活性中心氨基酸位點對蛋白質的結構和功能的關系的影響，最終選定3個突變位點R329、T369和N467進行飽和突變，產生多樣化突變酶，通過薄層層析結合高效液相色譜篩選方法獲得鍵選擇性提高的突變酶R329K和T369V。對結果進行分析討論，闡述了PGUS-E 酶的結構和功能的關系，為酶分子的蛋白質工程改造提供理論基礎和試驗依據，也為后續酶分子修飾及相關研究提供性質更為優良的酶源。

圖1 β-葡萄糖醛酸苷酶(PGUS-E)催化甘草酸示意圖

1 材料與方法

1.1 材料

1) 質粒和菌株: 克隆及表達宿主TOP10由北京理工大學生命學院生物轉化與微生態課題組保存。含有目標基因(GenBank登錄號：EU095019) 的組成型熱誘導質粒pHCE-gus由本實驗室構建。

2) 試劑：PCR反應相關試劑DNA 聚合酶、dNTPs等購自購自TaKaRa公司；質粒DNA小量提取試劑盒購自北京博邁德科技發展有限公司；Ⅰ內切酶購自Fermentas公司；DNA marker購自寶生物工程(大連) 有限公司；本實驗所用其他化學試劑均為分析純；PCR引物合成以及DNA測序由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。

1.2 飽和突變法構建突變體文庫

根據Statagene公司Quit-Change Kit原理，針對R329、T369、N467三位點設計了6條簡并引物(表1)。以質粒pHCE-gus為模板，擴增出含有突變的質粒。其中PCR的反應體系組成為: 10×PCR緩沖液2.5 μL，4種dNTPs混合溶液2 μL，上下游引物各1 μL，pHCE-gus模板DNA 1 μL，5 U/μL的DNA聚合酶及無菌水適量，反應總體積為25 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min 50 s，25個循環；72 ℃下延伸10 min。1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR反應產物，目標條帶為7 269 bp。PCR產物中加入Ⅰ限制性內切酶，在37 ℃酶解3 h以徹底消化甲基化原始模板，酶解產物采用熱擊法轉化Top10感受態細胞，轉化液涂布于LB平板上(含有100 μg/mL氨芐青霉素)，得到飽和突變文庫。

表1 定點突變引物表

Underlined and bold sequences denote the coding sequence of the mutated amino acid (N=A/G/C/T; K=G/T).

1.3 酶的組成型表達及突變文庫篩選

將LB固體培養板上的單菌落逐個挑到每孔含有1 mL LB液體培養基 (含100 μg/mL氨芐青霉素；0.5 g/L底物GL) 的Ep管中，30 ℃、200 r/min轉速的搖床中培養表達24 h后迅速轉至40 ℃，熱誘導裂解細胞釋放PGUS-E到培養基中，與培養基中底物GL反應24 h后，加10 μL的NaOH (1 mol/L) 終止反應。反應液中的底物GL和產物GAMG，GA通過TLC法進行定性初篩，判斷標準如下：在GL轉化率相同的條件下(≥90%)，GAMG的積累量越高，則酶的鍵選擇性越高，對GAMG積累量高于PGUS-E酶的優勢突變酶，用HPLC進一步進行定量復篩。

1.4 PGUS-E酶液制備及活性分析

將獲得的突變株接種于新鮮的LB培養基 (含100 μg/mL氨芐青霉素) 中30 ℃培養過夜，1% 接種量轉接于200 mL LB培養基，220 r/min 培養16 h后，將發酵液冷凍離心 (4 ℃， 5 000 r/min) 10 min，用醋酸緩沖液洗滌，重懸細胞，在冰浴中超聲破碎細胞 (300 W，工作2 s，間歇2 s，全程工作時間20 min)。破碎液于 12 000 r/min離心20 min收集上清，即為粗酶液。采用鎳親和層析對所得的粗酶液進行分離純化。首先用pH 8.0的 Tris-HCl的緩沖液平衡鎳柱，通過上樣將粗酶液裝載到鎳柱上，然后清洗雜蛋白將基線280降至最低并沖平。最后分別用50和200 mmol/L的咪唑溶液梯度洗脫目的蛋白，最后將洗脫液透析除鹽即得到純酶。

取100 μL酶液加200 μL含有1 g/L甘草酸(pH=5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液)，40 ℃反應 60 min后，添加10 μL NaOH (1 mol/L) 終止反應。取100 μL反應液添加900 μL甲醇，混合均勻，用HPLC檢測GL、GAMG及GA的含量。β葡萄糖醛酸苷酶的活力定義為：在上述條件下每分鐘消耗1 nmol甘草酸所需要的β-葡萄糖醛酸苷酶量為一個活力單位(U)。

1.5 最適溫度和pH的測定

按上述方法測定突變酶在不同pH (3.0?8.0) 和溫度 (25?60 ℃) 下的酶活力，原始酶與突變酶分別設定最高酶活為100%，以相對酶活力和pH，溫度關系作圖，確定酶的最適pH和溫度。

1.6 PGUS-E突變酶的鍵選擇分析

采用高效液相色譜(HPLC) 對反應混合物中底物GL及產物GAMG、GA進行定量分析。儀器主要參數：島津LC-10A，色譜柱：Shim-pack, VP-ODS (150 mm，4.6 mm)，檢測器：SPD，檢測波長：254 nm，流動相：甲醇：0.6%醋酸＝81：19，進樣量：10 μL，流速：1 mL/min，柱溫箱：40 ℃，工作站：LC solution。GL、GAMG、GA 的保留時間分別為5.2 min、11.7 min、 21.3 min。

數據處理計算公式如下:

轉化率 (CGL) =(SO–ST)/ SO×100%；

化學鍵選擇性(Scb)=PGAMG/(PGAMG+PGA) × 100%。

SO、ST分別代表底物GL的初始濃度和終濃度；PGAMG、PGA分別代表產物GAMG和GA的終濃度。

1.7 PGUS-E酶和突變酶的空間結構模擬

PGUS-E酶的三維結構通過SWISS-MODEL 蛋白模擬在線服務器 (http://www.expasy.ch/ swissmod/SWISS-MODEL.html) 進行同源模擬獲得，模板為來源的β-葡萄糖醛酸苷酶(EGUS) 晶體結構(PDB登錄號：3K46)，氨基酸序列比對結果顯示相似度達到54.34%。采用Pymol軟件理性分析和預測了活性中心氨基酸對PGUS-E鍵選擇性的影響，選取了突變位點。并且應用該軟件虛擬氨基酸突變，通過分析突變前后氨基酸極性、疏水作用、氫鍵等的變化，分析結構-鍵選擇性關系。闡述了PGUS-E的結構和功能的關系，為進一步的酶特性改造提供理論基礎。

2 結果與討論

2.1 PGUS-E酶鍵選擇性特異位點分析

PGUS-E 酶同源模擬獲得的理論結構說明它包含一個(α/β)8桶狀催化結構域，屬于(α/β)8水解酶亞組。(α/β)8類酶的活性部位均處于一個非常相似的位置，即位于連接β折疊鏈C端與α螺旋N端的環構成的漏斗形口袋底部，參與底物結合和催化作用氨基酸在這個口袋中[17-18]。PGUS-E的糖苷底物分子GL和GAMG的糖基部分均為葡萄糖醛酸，配基則不同(圖2)，說明PGUS-E對GL和GAMG的末端糖苷鍵的糖基識別較強，對配基結構識別性較低，可能導致鍵選擇性低。由此做出以下假設：糖苷鍵兩端結構識別決定酶的鍵選擇性，通過與GL末端糖苷鍵的配基結構識別相關的氨基酸突變可以提高PGUS-E酶鍵選擇性，最終使GAMG的產量提高。

大腸桿菌的β-葡萄糖醛酸苷酶(EGUS-E) 與PGUS-E同屬于GH2，其結構與功能關系為 PGUS-E的研究提供了有利參考。利用Pymol軟件對PGUS-E的模擬結構與EGUS-E及葡萄糖醛酸復合物的晶體結構 (PDB登錄號：3K4D) 進行比對，分析發現PGUS-E酶三維結構中Arg329、His332、Thr369、Asp414、Asn467、Asp505、Trp550、Arg563、Lys567、Asn569 (圖3) 位于底物結合口袋中，說明這些氨基酸與底物分子的糖基或者配基識別結合相關。依據文獻報道，β-葡萄糖醛酸苷酶中，Asp414、Asp505為催化殘基[19]，參與糖苷鍵的斷裂，His332、Arg563、Lys567、Asn569位于糖基結合位點，與糖基識別相關[20-21]。在PGUS-E酶結構中顯示，Trp550位于底物結合口袋的底部，是強疏水性氨基酸，保證催化反應的疏水環境，Arg329、Thr369、Asn467位于糖基結合位點的對立面，可能與底物分子配基部分的識別相關。綜上分析，為了確保選擇位點的準確性，最終選定與配基識別相關的3個位點 (Arg329、Thr369、Asn467) 進行飽和突變研究，以提高PGUS-E酶鍵的選擇性。

圖2 PGUS-E酶底物分子的結構示意圖

圖3 PGUS-E (綠)與EGUS復合物 (3K4D粉橙色)的結構比對示意圖

2.2 突變文庫的構建及篩選

利用帶有簡并密碼子的引物，以pHCE-gus 質粒為模板，通過PCR擴增對R329、T369、N467進行飽和突變，PCR擴增質粒結果如圖4所示。將PCR產物經過Ⅰ酶切消化轉化TOP10中，構建了R329、T369、N467的飽和突變文庫。通過TLC定性初篩和HPLC定量復篩相結合的方法對突變文庫篩選，通過基因測序及序列分析獲得了優勢突變酶R329K和T369V (圖5)。HPLC檢測結果計算獲得，原始的PGUS-E的轉化率達到90.1%時，鍵選擇性達到8.5%，T369V的轉化率達到90.3%時，鍵選擇性達到42.8%，與PGUS-E比較提升了34.3%；R329K的轉化率達到90.8%，鍵選擇性達到35.5%，與PGUS-E比較提升了26.9%。但N467位點飽和突變獲得的20種突變酶鍵選擇性并沒有提高，且催化GL的酶活力基本喪失。另外，對得到的R329K、T369V優勢突變進行組合，發現突變酶M3 (R329L/T369V) 的鍵選擇性并沒有進一步與提高。

圖4 飽和突變PCR擴增DNA電泳圖

圖5 PGUS-E突變酶篩選結果

2.3 PGUS-E突變酶活性分析

對PGUS-E突變酶的比酶活進行分析，發現與PGUS-E比較，突變酶R329K、T369V催化GL水解能力下降。如圖6所示，突變酶 T369V (3273 U/mg) 的比酶活為PGUS-E (4726 U/mg) 的69.3%，突變酶R329K (1492 U/mg) 比酶活僅為PGUS-E的31.6%。

2.4 突變酶的最適pH合溫度的測定

為了確定酶反應的最佳條件，考察了突變酶催化GL的最適pH和溫度，結果如圖7、8所示，突變酶T369V、R329K與PGUS-E的最適pH為5.0，最適溫度為40 ℃，說明突變氨基酸的引入并沒有影響酶的最適pH和最適 溫度。

圖6 PGUS-E酶及突變酶的比酶活

圖7 pH對PGUS-E及突變酶活力的影響

圖8 溫度對PGUS-E及突變酶活力的影響

2.5 突變酶的分析

為了進一步確定突變酶的作用機制，采用Autodock軟件對酶與底物GL進行對接模擬。圖9A?D依此為PGUS-E和T369V、R329K、N467D突變酶。

圖9A和圖9B比對顯示，突變酶T369V的第369位氨基酸由親水性蘇氨酸突變為疏水性纈氨酸，極性變化影響369位氨基酸所在的整個Loop環構象朝向疏水中心移動，增加了酶與GL的契合度，進而增強了酶的鍵選擇性。但是酶與底物GL之間的范德華力的增強，使得催化反應中結構重排的自由能壘變大，影響了酶活性殘基的釋放，減緩了新一輪底物進入活性中心速率，最終降低了酶催化效率。

圖9 PGUS-E和突變酶與GL作用的模擬結構圖

圖9A和圖9C比對顯示，R329與E353和T504之間各存在一個氫鍵的相互作用。突變酶 R329K的第329位氨基酸由精氨酸變為賴氨酸，兩者具有相似的極性及電荷性質，但側鏈變短，破壞了與E353和T504之間的氫鍵，引起 E505 位谷氨酸的位移，從而提高了酶的鍵選擇性。但是突變增加了催化位點與GL之間的距離，最終影響其催化效率。

圖9A和圖9D比對顯示，突變前N467分別與 E505 (催化殘基) 及T504之間形成一個氫鍵，且與兩者之間的距離很近，分別為1.3 ?和2.1 ?。故微小的變化影響催化殘基E505。這里以Asn長度和性質變化最小的Asp進行突變模擬，PGUS-E酶第467位天冬酰胺突變后，破壞了N467與E505之間的氫鍵，催化殘基E505與糖苷鍵結合構象發生變化，嚴重影響PGUS-E的催化效率。結果分析表明N467對維持酶功能有重要作用。

3 結論

本實驗通過SWISS-MODEL軟件模擬了PGUS-E酶的三維結構，通結構比對，利用Pymol軟件分析了底物分子與酶之間的相互作用，初步確定影響其鍵選擇性的部分位點。通過構建飽和突變文庫的研究，發現R329K和T369V突變使PGUS-E酶的鍵選擇性分別提高了26.9%，34.3%，突變酶催化GL生成的GAMG的產率和底物特異性增加。通過突變酶與底物GL作用的結構模擬，進一步分析了R329K和T369V鍵選擇性提高的機理，為進一步鍵選擇性改善提供了理論依據。

本研究對于PGUS-E酶的結構和功能關系的分析和預測進行了驗證和完善，為進一步闡明PGUS-E酶的鍵選擇性與結構關系奠定了基礎，同時為構建具有理想鍵選擇性和產物特異性的PGUS-E酶突變體提供了新的出發點。

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(本文責編 陳宏宇)

Semi-rational modification for improving bond selectivity of recombinant β-glucuronidase

Hongli Pu, BoLü, Dongxu Zhao, and Chun Li

,,100081,

To improve bond selectivity of recombinant β-glucuronidase in(PGUS-E), based on the PGUS-E structure guidance, three key points R329, T369 and N467 were identified to be responsible for the bond selectivity of PGUS-E, and further saturation mutagenesis was conducted. Two positive mutants R329K and T369V were obtained by a combined selection technique of thin-layer chromatography and high performance liquid chromatography. Compared to PGUS-E, the bond selectivity of mutants R329K and T369V increased by 26.9% and 34.3%, respectively; whereas the biochemical properties such as pH and temperature profile were unchanged. Nevertheless, the activity was decreased compared to PGUS-E. These results further confirmed that sites R329 and T369 played important roles for the bond selectivity and activity. In summary, this study significantly increased the bond selectivity of PGUS-E by structure guided saturation mutagenesis, providing experimental support for elucidating the relationship between the structure and function of PGUS-E.

βglucuronidase, glycyrrhetinic acid monoglucuronide, bond selectivity, site-saturation mutagenesis

December 2, 2014;

January 21, 2015

National Natural Science Foundation of China (Nos. 21176028, 21376028); National Science Fund for Distinguished Young Scholars of China (No. 21425624), Doctoral Fund of Ministry of Education of China (No. 20121101110050).

Chun Li.Tel/Fax: +86-10-68913171; E-mail: lichun@bit.edu.cn

國家科學自然基金(Nos. 20976014, 21376028)，國家杰出青年科學基金(No. 21425624)，高等學校博士學科點專項科研基金(No. 20121101110050) 資助。