3 種抗氧化 劑對硅酸鈉脅迫下粉紅單端孢（Trichothecium roseum）孢子生存能力的保護作用比較研究

趙冠華，牛黎莉*，羅榮濤，段偉鵬，張 蓉，畢 陽，張盛貴

（甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070）

3 種抗氧化 劑對硅酸鈉脅迫下粉紅單端孢（Trichothecium roseum）孢子生存能力的保護作用比較研究

趙冠華，牛黎莉*，羅榮濤，段偉鵬，張 蓉，畢 陽，張盛貴

（甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070）

本實驗研究了抗壞血酸（VC）、還原性谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）和半胱氨酸（cysteine，Cys）3 種抗氧化劑分別作為預防劑和治療劑對硅酸鈉和對應pH值溶液脅迫下粉紅單端孢（Trichothecium roseum）孢子存活力的保護作用。結果表明，3 種抗氧化劑均能使硅酸鈉脅迫下孢子的生存能力部分恢復，而使對應pH值脅迫下孢子的生存能力80%恢復；3 種抗氧化劑中VC的保護效果要優于GSH和Cys；3 種抗氧化劑作為預防劑的效果要優于其治療效果。

抗氧化劑；硅酸鈉；生存能力

粉紅單端孢（Trichothecium roseum）是重要的果蔬采后病原物，可引起蘋果的霉心病[1]、甜瓜的粉霉病[2-3]、芒果的果腐病[4]以及其他多種果蔬的采后病害[5]。此外，該病原物還能產生對人和動物有害的單端孢霉烯毒素[6-7]。目 前，對由T. roseum引起病害的控制主要采用異菌脲、嘧菌酯等化學合成的殺真菌劑[4]，但長期使用不僅存在藥物殘留危害、污染環境、而且會增加病原物的抗藥性[8]。因此，亟需尋找新的、更為安全有效的控制方法。

據報道，硅酸鈉對多種采后病原物具有廣譜的抑菌活性，可抑制菌絲生長和孢子萌發[9-13]，本課題組前期研究發現，硅酸鈉引起的細胞質膜損傷可能與其誘導菌體產生的過量活性氧（reactive oxygen spieces，ROS）有關。同樣，Qin Guozheng等[14]發現，用硼酸鹽處理擴展青霉（Penicillium expansum）后，菌體內有大量ROS積累，并促進了蛋白質的羰基化。用硼酸鹽處理的灰葡萄孢（Botrytis cinerea），發現菌絲細胞膜損傷，并伴有大量的內容物滲漏。氯化鋁和焦亞硫酸鈉等鹽類能引起對鹽敏感真菌的細胞膜丙二醛（methane dicarboxylic aldehyde，MDA）含量和膜脂飽和程度的提高，使得膜脂過氧化[15]。外源抗氧化物VC和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）能使ROS脅迫條件下的菌體P. expansum中ROS保持正常的生理穩態，并能修復由ROS引起的細胞損傷。但是，對硅酸鈉脅迫下外源抗氧化劑對孢子生存力保護效果的研究尚鮮見報道。

本實驗采用100 mmol/L硅酸鈉溶液和對應pH值溶液處理T. roseum孢子，研究3種抗氧化劑對脅迫條件下孢子存活率的保護效果與處理時間的關系；以及不同添加方式對孢子的保護效果進行比較；探討3種抗氧化劑對硅酸鈉脅迫下T. roseum孢子生存力的影響規律。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

T. roseum為甘肅農業大學食品科學與工程學院采后生物實驗室保存。

NaOH 天津市大茂化學試劑廠；硅酸鈉、吐溫-80、抗壞血酸（VC）、還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）、半胱氨酸（cysteine，Cys）、葡萄糖 天津市光復精細化工研究所；2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽（dichlorofluorescein diacetate，DCFH-DA）、熒光染料 美國Sigma公司；二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO） 美國Amresco公司。

1.2 儀器與設備

Olympus BX61熒光顯微鏡 奧林巴斯（中國）有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋 上海三申醫療器械有限公司；電熱鼓風干燥箱、電熱恒溫培養箱 上海一恒科學儀器有限公司；PHS-3C型pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；超凈工作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；振蕩培養箱 上海躍進醫療器械有限公司；XH-B旋渦混合器 江蘇康健醫療用品有限公司；電子天平 上海精科天美科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 孢子的收集

取28℃條件下培養10 d的T. roseum平板，加入含體積分數為0.05%的吐溫-80的無菌水，用玻璃棒刮下平板上的病原菌孢子，然后轉入50 mL三角瓶中，在WYX-A微型旋渦混合器上振蕩15 s，再用4層無菌紗布過 濾，濾液用血球計數板計數算出孢子懸浮液的濃度后，最后稀釋孢子懸浮液的濃度為1×106孢子/mL。

1.3.2 孢子生存能力的測定

參照Angelova等[16]的方法并修改，藥劑處理時，孢子懸浮液的濃度控制在約106孢子/mL左右，藥劑處理后，稀釋成104孢子/mL，吸取100 μL的孢子懸浮液，進行凃板，平板為馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基。每個處理5 個平板，在恒溫28 ℃條件下培養48 h后，記錄每個平板菌落形成數（CFU），求平均值。

1.3.3 硅酸鈉和對應pH值溶液處理后孢子中內源ROS的觀察

配制100 mmol/L的硅酸鈉溶液，用pH計測定硅酸鈉溶液在28 ℃條件下pH值為12.60，然后用10 mol/L的NaOH溶液調蒸餾水的pH值為12.60，得對應pH值溶液，121 ℃條件滅菌20 min后，待用。取上述孢子懸浮液2 mL，8 000×g離心10 min，棄上清，分別用無菌水、滅菌后的硅酸鈉溶液以及對應的pH值溶液各2 mL加入孢子中，28 ℃、150 r/min搖床中處理3 h，8 000×g離心5 min，50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）洗滌3 次，用500 μL的PBS重懸細胞。T. roseum孢子內源ROS的測定參照Qin Guozheng等[17]的方法并修改，每個離心管中添加熒光染料DCFH-DA（溶解在DMSO中，母液濃度為0.01 mol/L），使其終濃度為10 μmol/L，在28 ℃條件下孵育1 h后，真菌孢子在8 000×g離心5 min，并用PBS洗滌3 次。然后用熒光顯微鏡在激發光為藍色光下觀察發熒光的孢子數。每個處理重復3 次。

1.3.4 硅酸鈉和對應pH值溶液對孢子存活率的影響

參照Avis等[18]的方法并修改，取上述孢子懸浮液2 mL，8 000×g離心10 min，棄上清，分別用無菌水、滅菌后的100 mmol/L的硅酸鈉溶液以及對應的pH值為12.60的溶液各2 mL加入孢子中，28 ℃、150 r/min搖床中處理不同的時間（0、30 min、1 h、3 h、6 h、9 h），隨后進行孢子存活率的測定。每個處理重復3 次。

1.3.5 外源抗氧化劑作為預防劑對孢子存活率的保護

在上述無菌水、滅菌后的硅酸鈉、滅菌后的對應pH值處理液中分別加 入3 種外源抗氧化劑VC、GSH和Cys，使抗氧化劑的終濃度達到100 μmol/L，待用。取上述孢子懸浮液2 mL，8 000×g離心10 min，棄上清，分別加入2 mL加了抗氧化劑的各溶液，28 ℃，150 r/min搖床中處理不同的時間（0、30 min、1 h、3 h、6 h、9 h），參照1.3.2節的方法進行孢子保護率的測定。每個處理重復3 次。

1.3.6 外源抗氧化劑作為治療劑對孢子存活率的保護

同上述1.3.4節的方法處理孢子后，稀釋成104孢子/mL后，吸取100 μL涂布于分別含有100 μmol/L抗氧化劑（VC、GSH、Cys）的PDA培養基中，參照1.3.2節的方法進行孢子保護率的測定。每個處理重復3 次。

1.4 數據處理

全部數據用Microsoft Excel 2007處理系統進行統計處理。

2 結果與分析

2.1 硅酸鈉和對應pH值溶液處理對孢子中ROS含量的影響

圖1 硅酸鈉和對應pH值溶液對T. rosseeuumm分生孢子ROS的影響Fig.1 Effects of sodium silicate and corresponding pH on the production of reactive oxygen species in T. roseum spores

由圖1可知，與對照組相比，100 mmol/L硅酸鈉和對應pH值溶液處理3 h后，孢子中內源ROS含量均有所增加，且硅酸鈉處理后，發熒光的孢子的比率顯著高于對照和對應pH值溶液處理。因此，認為硅酸鈉引起T. roseum氧化脅迫要比對應pH值溶液處理引起的氧化脅迫更嚴重。

2.2 硅酸鈉和對應pH值溶液對孢子存活率的影響

圖2 硅酸鈉和對應pH值溶液對T. roseum分生孢子處理不同的時間后對其存活率的影響Fig.2 Effects of sodium silicate and corresponding pH on spore viability of T. roseum

由圖2可知，100 mmol/L硅酸鈉和對應pH值溶液處理對孢子存活均有抑制作用，但是硅酸鈉和對應pH值溶液處理之間存在差異。當處理時間在1 h以內時，各處理對孢子的存活率影響變化不大；隨著處理時間的延長，孢子存活率顯著降低，且硅酸鈉處理顯著低于對照和對應pH值溶液處理。在整個處理期間，對照組的孢子存活率保持穩定。當處理時間為9 h時，硅酸鈉處理的孢子的存活率僅為對照的5.9%，是對應pH值溶液處理的12.8%。

2.3 3 種抗氧化劑作為預防劑對孢子保護率的影響

圖3 3 種外源抗氧 化劑對硅酸鈉和對應pH處理的T. roseum孢子保護率的影響Fig.3 Effects of three exogenous antioxidants as protective agents on spore viability of T. roseum treated with sodium silicate and corresponding pH

由圖3可知，VC、GSH、Cys作為預防劑均能增加硅酸鈉和對應pH值溶液處理的孢子的存活率，但存在差異。當處理時間小于1 h時，3 種抗氧化劑對孢子的保護率的影響變化較小，這可能是由于藥劑短時間處理，對孢子的存活率影響變化也是較小的；當處理時間超過1 h時，隨著處理時間的延長，其保護效果非常顯著。其中VC的保護效果最好，其次為GSH，最后為Cys。當處理9 h時，抗氧化劑VC能使36%的孢子免受硅酸鈉的破壞，能使48%的孢子免受pH值溶液處理的破壞（圖3A）；GSH對其保護率分別為32%和40%（圖3B）；Cys分別為29%和38%（圖3C）。

2.4 3 種抗氧化劑作為治療劑對孢子治療率的影響

由圖4可知，3 種抗氧化劑VC、GSH和Cys對孢子的治療率均有顯著改善，但存在差異。當處理時間低于1 h時，3 種抗氧化劑對孢子的治療率的影響變化較??；當處理時間超過1 h時，隨著處理時間的延長，其治療效果非常顯著。VC的治療效果最好，GSH和Cys的治療效果相差不大。處理9 h時，抗氧化劑VC能挽救11%的孢子免受硅酸鈉的破壞，挽救28%的孢子免受對應pH值溶液的破壞（圖4A）?？寡趸瘎〨SH的治療率分別為9.9%和25.6%（圖4B），Cys分別為9.3%和20.6%（圖4C）。

圖4 3 種外源抗氧化劑對硅酸鈉和對應pH處理的T. roseum孢子治療率的 影響Fig.4 Effect of three exogenous antioxidants as therapeutic agents on spore viability of T. roseum treated with sodium silicate and corresponding pH

2.5 兩種不同添加抗氧化劑方式對提高孢子存活率的比較

圖5 抗氧化劑不同添加方式對硅酸鈉和對應pH值溶液脅迫下的T. roseum seum分生孢子存活率的影響Fig.5 Comparative effects of three antioxidants as protective or therapeutic agents on spore viability of T. roseum treated with sodium silicate and corresponding pH

由圖5可知，兩種不同添加抗氧化劑方式對硅酸鈉和對應pH值溶液脅迫下的孢子的存活率均有顯著影響，但之間存在差異。與硅酸鈉脅迫下的孢子相比，抗氧化劑能使pH值溶液脅迫下的孢子保持較高的存活率；而且將抗氧化劑作為預防劑的效果優于治療劑。處理9 h后，VC（圖5A）、GSH（圖5B）和Cys（圖5C）作為預防劑時，硅酸鈉脅迫下的孢子的存活率分別為41.8%、37.8%和34.8%，而對應pH值溶液脅迫下的孢子的存活率分別達到93.4%、85.4%和83.4%；作為治療劑時，硅酸鈉脅迫下的孢子的存活率分別為16.8%、15.7%和15.1%，而對應pH值溶液脅迫下的孢子的存活率分別達到83.1%、82.1%和80%。但是，硅酸鈉處理的孢子，不管是何種添加方式，對其存活率只有部分的改善，最高也只能達到41.8%；而對應pH值溶液處理，外源抗氧化劑能使T. roseum孢子存活率最低保持在80%的水平。

3 討 論

本研究發現，經100 mmol/L硅酸鈉和對應pH值溶液處理的孢子中ROS含量明顯升高，且硅酸鈉引起的孢子的氧化脅迫要比對應pH值溶液嚴重。同時硅酸鈉和對應pH值溶液均使孢子的存活率顯著下降，但硅酸鈉的影響明顯高于對應pH值溶液。外源抗氧化劑對硅酸鈉脅迫下的孢子的生存能力的保護效果要弱于對應pH值溶液?？寡趸瘎┑奶砑臃绞?，預防效果優于治療效果。且3 種抗氧化劑，VC的效果要優于GSH，GSH要優于Cys。

在正常的生理條件下細胞內的ROS處于不斷產生和清除的動態平衡中，ROS不僅作為重要的信號分子參與細胞發育、分化和衰老等過程[19-21]。而且參與環境脅迫因子誘導的生理響應過程，引起殺菌劑對菌體的毒害[22]，誘導細胞發生凋亡[23]?；钚匝醯淖饔镁哂袃擅嫘?，當其處于低濃度條件下往往作為信號分子參與細胞的生理調控，但濃度過高或長時間在胞內滯留，氧代謝失調，氧自由基動態平衡被破壞，核酸、蛋白、脂質和糖類等受到氧化并喪失正常的功能，細胞結構和功能可能會受到損傷甚至并出現死亡[24]。對微生物而言，都進化成氧化脅迫響應（oxidative stress response，OSR）機制來清除胞內逐漸升高的ROS。而其中GSH、植物螯合肽、VC、多胺、黃酮類、生物堿和類胡蘿卜素等物質是主要的氧化脅迫防御系統[20]。

實驗結果表明，VC、GSH和Cys均能減輕硅酸鈉和對應pH值溶液對分生孢子的損傷；而且無論是作為保護劑還是治療劑，VC的效果要優于GSH和Cys，這可能和抗氧化劑的作用機理有關。VC作為抗氧化劑能通過一系列氧化還原反應來直接清除H2O2[25]。而GSH和Cys是一種普遍存在的含硫醇還原劑，它可以通過還原細胞內二硫鍵來保持細胞內的氧化還原平衡，保護例如外源性化學物質 和重金屬等對細胞大分子的損傷[24]。

同時發現外源抗氧化劑對硅酸鈉脅迫和對應pH值溶液脅迫下的分生孢子的損傷均具有減輕作用，但是減輕程度，對應pH值溶液要遠遠優于硅酸鈉。Liu Jia等[9]認為硅酸鈉的抗真菌活性，與硅酸鈉的堿性直接相關。但是本實驗發現與100 mmol/L硅酸鈉溶液堿性相同的NaOH溶液脅迫下的孢子，添加抗氧化劑時，發現其保護效果要遠高于硅酸鈉脅迫的孢子。因此，推測硅酸鈉的抑菌效果可能與其堿性有一定的關系外，最主要可能和硅酸根離子直接相關。

抗氧化劑的添加方式，對孢子生存力的保護存在差異，這可能是由于作為預防劑時，對孢子產生的ROS能及時清除，能保護細胞膜或一 些蛋白質等大分子物質免受ROS的損傷，從而提高孢子的生存力；作為治療劑時，孢子已產生的ROS使細胞質膜受損或已使蛋白質、核酸等大分子物質氧化損傷而發生不可逆變化，對其治療效果有限。因此，其預防效果優于治療效果。

綜上所述，外源抗氧化劑VC、GSH和Cys對硅酸鈉和對應pH值溶液脅迫下的分生孢子的存活能力均具有一定的保護作用，預防效果優于治療效果，而且VC的效果要優于GSH和Cys；對硅酸鈉脅迫下的孢子的存活力只能部分恢復，而能使對應pH值脅迫下的孢子的生存力80%恢復；因此，硅酸鈉對T. roseum的抑制效果除了與其改變環境pH值外，更多地涉及硅酸根離子的影響。至于硅酸根離子是如何影響菌體自身產生和清除ROS，以及抗氧化劑如何參與ROS的清除尚有待進一步研究。

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Comparison of Protective Effects of Three Antioxidants on Spore Viability of Trichothecium roseum under Sodium Silicate Stress

ZHAO Guanhua, NIU Lili*, LUO Rongtao, DUAN Weipeng, ZHANG Rong, BI Yang, ZHANG Shenggui
(College of Food Science and Engineering, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China)

The protective effects of three antioxidants on spores ofTrichothecium roseumunder sodium silicate and corresponding pH stress were studied by comparing the spore viability. The results showed that all the investigated antioxidants enabled the sodium silicate-stressed spor es to restore partially their viability. Moreover, the viability of 80% spores under corresponding pH stress was restored. VC had better protective effect onTrichothecium roseumspores than GSH and Cys. The preventive effect of the three antioxidants was better than their therapeutic effect.

antioxidants; sodium silicate; spore viability

TS255.3

A

10.7506/spkx1002-6630-201517036

2014-11-24

2013年國家級大學生創新創業訓練計劃項目（201310733019）

趙冠華（1990—），男，本科，研究方向為食品科學與工程。E-mail：lookgo@qq.com

*通信作者：牛黎莉（1979—），女，講師，博士研究生，研究方向為采后防腐和保鮮。E-mail：niull@gsau.edu.cn